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AlbaRosea金蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCAMBIA1300系列載體表達(dá)初始ATG
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各位大俠、 請(qǐng)問(wèn)一下就是pCAMBIA1301,1304等幾個(gè)載體里邊。順時(shí)針的35s啟動(dòng)子下游，是從哪里的ATG開(kāi)始讀的呀？如果用ncoI 和bgl II 是不是都是從NCO I 的ATG開(kāi)始讀的呀？那么如果用這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，是不是都要在目標(biāo)序列里補(bǔ)上兩個(gè)堿基啊才能保證不會(huì)移碼��？（ 1 catggtagat ctgactagta aaggagaaga，摘自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF234298） 生物基礎(chǔ)薄弱啊。忘高人指點(diǎn)一下啊。謝謝。 |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
AlbaRosea: 金幣+10, ★★★很有幫助, 有幫助。謝謝 2013-07-11 16:28:39
myprayer: 金幣+2, 回答很好，perfect 2013-07-12 08:35:13
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| 是的。如果你的基因開(kāi)始是序列是ATGG，克隆設(shè)計(jì)5'引物的時(shí)候可以直接利用NcoI酶切位點(diǎn)的序列，從第五個(gè)堿基開(kāi)始克隆。如果基因的第四個(gè)堿基不是G，你需要在基因序列前面補(bǔ)充兩個(gè)堿基。 |
2樓2013-07-11 07:52:20
AlbaRosea
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3樓2013-07-12 20:10:35
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如果是融合蛋白，如果你的目的基因在GFP或者GUS前面（比方說(shuō)你用NcoI, BglII, SpeI），你需要去掉目的基因的終止密碼子并核對(duì)從你克隆位點(diǎn)后面的序列到融合基因的ATG之間的堿基數(shù)目是3的倍數(shù)，如果不是需要在克隆基因時(shí)的3'引物處補(bǔ)堿基。如果你把目的基因連在報(bào)告基因后面，你需要保證的是去掉報(bào)告基因終止密碼子，并且從此處到目的基因的ATG之間的堿基數(shù)目是3的倍數(shù)而不移碼。如果做融合蛋白，為了保證折疊的獨(dú)立和穩(wěn)定，往往可以在兩個(gè)蛋白之間加linker。 |
4樓2013-07-12 23:05:48
AlbaRosea
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5樓2013-07-13 08:55:30
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【答案】應(yīng)助回帖
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AlbaRosea: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝。。太謝謝了。。 2013-07-13 16:12:49
AlbaRosea: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝。。太謝謝了。。 2013-07-13 16:12:49
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linker有很多種，就是短小的序列不形成高級(jí)折疊，使融合蛋分別獨(dú)立折疊。常用的有甘氨酸linker。構(gòu)建載體的時(shí)候往往在插入的位點(diǎn)與要融合的標(biāo)簽直接有一些堿基，所以通常情況下不做任何處理也往往可以成功表達(dá)出融合蛋白。我只是提醒一下而已。 目的基因前面加兩個(gè)堿基一般是比較隨意的，只要不形成終止子或者Pro這種對(duì)蛋白折疊構(gòu)象發(fā)生較大影響的氨基酸就可以了。表達(dá)出來(lái)的蛋白比原來(lái)的目標(biāo)蛋白多兩個(gè)氨基酸，你的ATG可以保留。多兩個(gè)氨基酸一般不會(huì)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能造成什么影響。 |
6樓2013-07-13 09:18:19
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