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AlbaRosea金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCAMBIA1300系列載體表達(dá)初始ATG
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各位大俠、 請(qǐng)問(wèn)一下就是pCAMBIA1301,1304等幾個(gè)載體里邊。順時(shí)針的35s啟動(dòng)子下游，是從哪里的ATG開(kāi)始讀的呀？如果用ncoI 和bgl II 是不是都是從NCO I 的ATG開(kāi)始讀的呀？那么如果用這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，是不是都要在目標(biāo)序列里補(bǔ)上兩個(gè)堿基啊才能保證不會(huì)移碼��？（ 1 catggtagat ctgactagta aaggagaaga，摘自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF234298） 生物基礎(chǔ)薄弱啊。忘高人指點(diǎn)一下啊。謝謝。 |
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cicelyzh
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如果是融合蛋白，如果你的目的基因在GFP或者GUS前面（比方說(shuō)你用NcoI, BglII, SpeI），你需要去掉目的基因的終止密碼子并核對(duì)從你克隆位點(diǎn)后面的序列到融合基因的ATG之間的堿基數(shù)目是3的倍數(shù)，如果不是需要在克隆基因時(shí)的3'引物處補(bǔ)堿基。如果你把目的基因連在報(bào)告基因后面，你需要保證的是去掉報(bào)告基因終止密碼子，并且從此處到目的基因的ATG之間的堿基數(shù)目是3的倍數(shù)而不移碼。如果做融合蛋白，為了保證折疊的獨(dú)立和穩(wěn)定，往往可以在兩個(gè)蛋白之間加linker。 |
4樓2013-07-12 23:05:48
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 是的。如果你的基因開(kāi)始是序列是ATGG，克隆設(shè)計(jì)5'引物的時(shí)候可以直接利用NcoI酶切位點(diǎn)的序列，從第五個(gè)堿基開(kāi)始克隆。如果基因的第四個(gè)堿基不是G，你需要在基因序列前面補(bǔ)充兩個(gè)堿基。 |
2樓2013-07-11 07:52:20
AlbaRosea
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3樓2013-07-12 20:10:35
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高手，覺(jué)得你說(shuō)的很有道理啊。。就是不懂兩個(gè)蛋白間的linker怎么選擇��？如果覺(jué)得菜鳥(niǎo)，我可以下來(lái)自己研究一下。 主要的問(wèn)題是，我切掉BGLII的時(shí)候，往我的目的基因前邊加堿基，這兩個(gè)堿基怎么選擇�。勘磉_(dá)的蛋白都不是從我的ATG開(kāi)始的會(huì)不會(huì)就不是我的蛋白��？那我的那個(gè)ATG還要么？表達(dá)出來(lái)的是什么東東呢？ 謝謝大俠啦，終于找到了一個(gè)明白人。。麻煩啦。。這個(gè)是我最糾結(jié)的問(wèn)題。。 |
5樓2013-07-13 08:55:30
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