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echochen1017

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[交流] 質(zhì)粒上定點突變不用DpnI酶消化的后果

本人在已構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒上定點突變，但沒有使用消化酶，直接轉(zhuǎn)化，有轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒，測序，卻發(fā)現(xiàn)在設計好的位點沒有發(fā)生突變，想交流一下，是否跟消化酶有關，想知道整個詳細的PCR過程和轉(zhuǎn)化后在質(zhì)粒模板和PCR產(chǎn)物在宿主菌中復制克隆的效率。謝謝啦~~~

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1樓 2013-07-17 09:40:53

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cicelyzh

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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:59

DpnI酶是要消化掉模板質(zhì)粒。如果沒有做消化直接轉(zhuǎn)化，當然有可能沒有突變啦。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率非常高，如果沒有消化掉模板，你得到的克隆基本上應該都是原質(zhì)粒。

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2樓2013-07-17 09:48:30

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gyesang

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5樓: Originally posted by echochen1017 at 2013-07-17 10:26:10
這個有文獻支撐或數(shù)據(jù)支撐么？...

這是有的啊，模板質(zhì)粒帶有甲基化（質(zhì)粒需從dam,dcm非缺陷型的大腸桿菌菌株中提取，比如DH5a），PCR產(chǎn)生的DNA鏈不帶甲基化，DpnI的一個特性就是要其識別位點被甲基化后其才能切割DNA，這樣就把環(huán)狀DNA鏈和新和成的PCR產(chǎn)物鏈給區(qū)分開了，其只降解質(zhì)粒DNA鏈，不降解PCR產(chǎn)物鏈,經(jīng)過轉(zhuǎn)化，PCR產(chǎn)物鏈經(jīng)過修復形成環(huán)狀，從而完成突變

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10樓2013-07-18 23:07:07

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gyesang

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-07-21 08:12:13

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4樓: Originally posted by echochen1017 at 2013-07-17 10:12:17
轉(zhuǎn)的是DH5α，最后的質(zhì)粒里突變的產(chǎn)物能占多少呢？...

比如起始質(zhì)粒模板量為n,你的PCR循環(huán)為30個的話，那么最后的質(zhì)粒里突變的產(chǎn)物占多少呢？告訴你，突變的產(chǎn)物為30n，是模板質(zhì)粒的30倍，而不是n^30，因為其是線性擴增而不是指數(shù)擴增，至于為什么，你可以在紙上比劃比劃

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11樓2013-07-18 23:10:06

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pyphappy

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需要用消化酶消化后再轉(zhuǎn)化

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13樓2013-10-28 15:13:57

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用DpnIi消化是一方面，但如果轉(zhuǎn)大腸桿菌DMT的話，是否消化關系不大。一般正確率在99%以上。

3樓2013-07-17 10:06:55

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3樓: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果轉(zhuǎn)大腸桿菌DMT的話，是否消化關系不大。一般正確率在99%以上。

轉(zhuǎn)的是DH5α，最后的質(zhì)粒里突變的產(chǎn)物能占多少呢？

4樓2013-07-17 10:12:17

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echochen1017

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 09:48:30
DpnI酶是要消化掉模板質(zhì)粒。如果沒有做消化直接轉(zhuǎn)化，當然有可能沒有突變啦。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率非常高，如果沒有消化掉模板，你得到的克隆基本上應該都是原質(zhì)粒。

這個有文獻支撐或數(shù)據(jù)支撐么？

5樓2013-07-17 10:26:10

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echochen1017(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 呵呵！的確是跟零無限趨近 2013-07-18 23:10:52

轉(zhuǎn)DH5α的話，正確率基本為0

6樓2013-07-17 10:34:13

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huanghznd

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echochen1017(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流！ 2013-07-19 00:03:58

DH5α沒有甲基化酶消化原始模板，轉(zhuǎn)DMT的話可以消化原始的甲基化模板，當然體外用DpnIi消化是雙保險。

7樓2013-07-17 10:36:25

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shanqian1988

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gyesang: 金幣+1, 鼓勵回帖交流！ 2013-07-19 00:04:51

一般用DpnI消化后轉(zhuǎn)化長出來還有20%-30%是你的原始模板呢，所以如果不消化，結(jié)果真的很不理想的

8樓2013-07-17 11:06:30

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echochen1017

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8樓: Originally posted by shanqian1988 at 2013-07-17 11:06:30
一般用DpnI消化后轉(zhuǎn)化長出來還有20%-30%是你的原始模板呢，所以如果不消化，結(jié)果真的很不理想的

有相關文獻或資料嗎？能給我看一下嗎？

9樓2013-07-17 11:46:14

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yunlongma

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11樓: Originally posted by gyesang at 2013-07-18 23:10:06
比如起始質(zhì)粒模板量為n,你的PCR循環(huán)為30個的話，那么最后的質(zhì)粒里突變的產(chǎn)物占多少呢？告訴你，突變的產(chǎn)物為30n，是模板質(zhì)粒的30倍，而不是n^30，因為其是線性擴增而不是指數(shù)擴增，至于為什么，你可以在紙上比劃比 ...

請問，以構(gòu)建好的質(zhì)粒為模板，用quikchange法進行定點突變，為什么是線性擴增而不是指數(shù)擴增，我還是沒有想明白……
是因為pcr產(chǎn)物含有staggered nick，而不能作為模板嗎？

還有得到的pcr產(chǎn)物是環(huán)狀而且?guī)в衧raggered nick嗎？
還是說，得到的pcr產(chǎn)物是線性的？

謝謝！！

12樓2013-10-04 11:12:48

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3樓: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果轉(zhuǎn)大腸桿菌DMT的話，是否消化關系不大。一般正確率在99%以上。

體內(nèi)降解：原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌（DMT）降解，
而去甲基化擴增產(chǎn)物不會被降解。
體外降解：甲基化模板可被Dpn1識別、切割，而去甲基化擴增產(chǎn)物不會被降解。
篩選依據(jù)：來自大腸桿菌的質(zhì)粒99％發(fā)生甲基化；PCR產(chǎn)物是去甲基化的產(chǎn)物。
問題是：PCR產(chǎn)物在體內(nèi)甲基化之后不會被DMT降解嗎？？還有原始質(zhì)粒就是甲基化的啊在體內(nèi)不會被降解嗎？其實是一個問題，搞不懂�。�！還有，什么是DMT啊？

14樓2014-05-20 13:38:26

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imsmiler

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引用回帖:

12樓: Originally posted by yunlongma at 2013-10-04 11:12:48
請問，以構(gòu)建好的質(zhì)粒為模板，用quikchange法進行定點突變，為什么是線性擴增而不是指數(shù)擴增，我還是沒有想明白……
是因為pcr產(chǎn)物含有staggered nick，而不能作為模板嗎？

還有得到的pcr產(chǎn)物是環(huán)狀而且?guī)в衧r ...

模板只能是最初的質(zhì)粒，后來擴增出來的有nick的不能作為模板吧。普通PCR，模板是越來越多的。這種突變法pcr模板數(shù)量是不變的，所以是線性擴增。

15樓2014-08-09 16:15:34

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16樓2014-08-09 18:19:29

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jurkat.1640

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不要Dpn I酶簡直就是技術的倒退

17樓2014-08-12 15:28:42

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