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履霜木蟲 (正式寫手)
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[求助]
免疫熒光染色，western blot均有目的蛋白，但是RT-PCR總是沒有條帶
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 如題了，大家?guī)兔ο胂肓耍@個(gè)蛋白是和脂肪代謝有關(guān)的，卵母細(xì)胞上面的。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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矜天
木蟲 (正式寫手)
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2樓2013-07-17 18:09:46
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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履霜: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-07-18 08:12:18
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履霜: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-07-18 08:12:18
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RT-PCR操作有問題吧。 在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有PCR產(chǎn)物的可能原因與對(duì)策： （1）RNA被降解（可能是主要的問題） 對(duì)策：①在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術(shù)分離RNA； ②在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲(chǔ)存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時(shí)加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 （2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑 對(duì)策：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗�？梢约尤胩窃�0.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。（逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對(duì)照RNA 同樣品混合，同對(duì)照 對(duì)策：①在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術(shù)分離RNA； ②在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲(chǔ)存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時(shí)加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 （3）多糖同RNA共沉淀 對(duì)策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 對(duì)策：①確定退火溫度以適合引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。（逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對(duì)照RNA 同樣品混合，同對(duì)照 RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑。 （3）多糖同RNA共沉淀 對(duì)策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 對(duì)策：①確定退火溫度以適合引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃ 保溫10分鐘。②對(duì)于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或 隨機(jī)六聚體。③確定GSP是反義序列。 （5）起始RNA量不夠 對(duì)策：增加RNA量。對(duì)于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg隨機(jī)六聚體。③確定GSP是反義序列。 隨機(jī)六聚體。③確定GSP是反義序列。 （5）起始RNA量不夠 對(duì)策：增加RNA量。對(duì)于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 （6）RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多 對(duì)策：①將RNA 和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退 火。②提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對(duì) SuperScriptⅡ可以到50℃，對(duì)ThermoScript 可以到 65℃。注意：不要在＞60℃時(shí)使用 oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對(duì)于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反 應(yīng)溫度≤65℃。不要在高于37℃時(shí)使用M-MLV。③如果不需要全長(zhǎng)cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。 （7）引物或模板對(duì)殘余的RNA模板敏感 對(duì)策：在PCR前用RNaseH處理。 （8）靶序列在分析的組織中不表達(dá) 對(duì)策：嘗試其他靶序列或組織 （9）PCR沒有起作用 對(duì)策：對(duì)兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 |
3樓2013-07-17 23:19:21
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
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1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
如果是卵母細(xì)胞的話，那很好解釋。當(dāng)然前提是你的rtpcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果是靠得住的 。MII期的卵母細(xì)胞中積累了許多母源性的mRNA和蛋白，為受精到合子基因激活（ZGA）這段時(shí)間支持胚胎的發(fā)育。因?yàn)檫@段時(shí)期受精卵中雌雄原核正在不斷接近而重新形成2倍體，形成后還要經(jīng)歷表觀遺傳修飾的過程，所以合子基因組是不或極弱表達(dá)的，胚胎所有的活動(dòng)都需要靠母源性mRNA翻譯為蛋白以及已有蛋白去完成（現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)好像還有小RNA什么的），mRNA的翻譯、降解及蛋白的降解都是受到非常嚴(yán)格的調(diào)控的。 一般情況是可以檢測(cè)到mRNA，但是卻沒有這種蛋白。樓主的情況比較少見，有蛋白而沒有mRNA，說明這種蛋白對(duì)于卵母細(xì)胞是非常重要的，但是受精后（至少在ZGA之前）卻并不需要或者不再多需要，所以沒有它的mRNA儲(chǔ)存。這是非常有趣的，好好做吧，也許可以出好文章。到時(shí)候要多給我金幣昂  斑竹，這回可以給個(gè)EPI了吧？已經(jīng)寫了這么多，講的這么詳細(xì)了。非專業(yè)蟲子也應(yīng)該能看懂了。 |
4樓2013-07-17 23:41:58
履霜
木蟲 (正式寫手)
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