 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2058 | 回復(fù): 5 | |||||
| 本帖產(chǎn)生 2 個 MolEPI ，點擊這里進(jìn)行查看 | |||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||||
履霜木蟲 (正式寫手)
|
[求助]
免疫熒光染色，western blot均有目的蛋白，但是RT-PCR總是沒有條帶
|
||||
 如題了，大家?guī)兔ο胂肓�，這個蛋白是和脂肪代謝有關(guān)的，卵母細(xì)胞上面的。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有133人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- westernblot 目標(biāo)蛋白無條帶
已經(jīng)有9人回復(fù)
- RT-PCR、western blot檢測所需細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加藥處理時間梯度？細(xì)胞數(shù)量如何統(tǒng)一？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- RT-PCR時GAPDH條帶不一樣，目的條帶呈涂抹的模糊帶如何改進(jìn)~~
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 14kd的蛋白，做westernblot，電轉(zhuǎn)條件是怎樣的
已經(jīng)有11人回復(fù)
- RT-PCR的cDNA不能擴增出目的條帶，只有內(nèi)參基因能擴增出來
已經(jīng)有14人回復(fù)
- RT-PCR沒有出現(xiàn)內(nèi)參基因的條帶和目的條帶，請問是什么原因？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 有沒有人用Western blot在做17kDa蛋白質(zhì),求經(jīng)驗�。。�
已經(jīng)有22人回復(fù)
- rna終于提取出來了，可是反轉(zhuǎn)錄pcr（rt pcr）沒有條帶
已經(jīng)有19人回復(fù)
- RT-PCR時GAPDH能跑出來，但目的條帶跑不出來~~
已經(jīng)有7人回復(fù)
- RT-PCR跑出來的條帶沒有量效關(guān)系怎么辦？什么原因
已經(jīng)有3人回復(fù)
- Western Blot實驗的蛋白條帶都連在一起
已經(jīng)有37人回復(fù)
- 【求助/交流】純化酶切后的膜蛋白做Western blot沒條帶，why？
已經(jīng)有9人回復(fù)
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
-
專家經(jīng)驗: +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時
- 蟲號: 1766465
- 注冊: 2012-04-19
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-18 00:45:31
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:51:49
履霜: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-07-18 08:12:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-18 00:45:31
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:51:49
履霜: 金幣+2, ★★★很有幫助 2013-07-18 08:12:18
|
RT-PCR操作有問題吧。 在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有PCR產(chǎn)物的可能原因與對策： （1）RNA被降解（可能是主要的問題） 對策：①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術(shù)分離RNA； ②在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 （2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑 對策：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗�？梢约尤胩窃�0.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。（逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對照RNA 同樣品混合，同對照 對策：①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術(shù)分離RNA； ②在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 （3）多糖同RNA共沉淀 對策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 對策：①確定退火溫度以適合引物。對于隨機六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。（逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對照RNA 同樣品混合，同對照 RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗抑制劑。 （3）多糖同RNA共沉淀 對策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 對策：①確定退火溫度以適合引物。對于隨機六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃ 保溫10分鐘。②對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或 隨機六聚體。③確定GSP是反義序列。 （5）起始RNA量不夠 對策：增加RNA量。對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg隨機六聚體。③確定GSP是反義序列。 隨機六聚體。③確定GSP是反義序列。 （5）起始RNA量不夠 對策：增加RNA量。對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 （6）RNA模板二級結(jié)構(gòu)太多 對策：①將RNA 和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退 火。②提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對 SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript 可以到 65℃。注意：不要在＞60℃時使用 oligo(dT)引物，選擇一個在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反 應(yīng)溫度≤65℃。不要在高于37℃時使用M-MLV。③如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機引物。 （7）引物或模板對殘余的RNA模板敏感 對策：在PCR前用RNaseH處理。 （8）靶序列在分析的組織中不表達(dá) 對策：嘗試其他靶序列或組織 （9）PCR沒有起作用 對策：對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 |
3樓2013-07-17 23:19:21
矜天
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 10054.1
- 散金: 1114
- 紅花: 2
- 帖子: 816
- 在線: 102.2小時
- 蟲號: 1228488
- 注冊: 2011-03-10
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
2樓2013-07-17 18:09:46
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
如果是卵母細(xì)胞的話，那很好解釋。當(dāng)然前提是你的rtpcr實驗結(jié)果是靠得住的 。MII期的卵母細(xì)胞中積累了許多母源性的mRNA和蛋白，為受精到合子基因激活（ZGA）這段時間支持胚胎的發(fā)育。因為這段時期受精卵中雌雄原核正在不斷接近而重新形成2倍體，形成后還要經(jīng)歷表觀遺傳修飾的過程，所以合子基因組是不或極弱表達(dá)的，胚胎所有的活動都需要靠母源性mRNA翻譯為蛋白以及已有蛋白去完成（現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)好像還有小RNA什么的），mRNA的翻譯、降解及蛋白的降解都是受到非常嚴(yán)格的調(diào)控的。 一般情況是可以檢測到mRNA，但是卻沒有這種蛋白。樓主的情況比較少見，有蛋白而沒有mRNA，說明這種蛋白對于卵母細(xì)胞是非常重要的，但是受精后（至少在ZGA之前）卻并不需要或者不再多需要，所以沒有它的mRNA儲存。這是非常有趣的，好好做吧，也許可以出好文章。到時候要多給我金幣昂  斑竹，這回可以給個EPI了吧？已經(jīng)寫了這么多，講的這么詳細(xì)了。非專業(yè)蟲子也應(yīng)該能看懂了。 |
4樓2013-07-17 23:41:58
履霜
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 3252.9
- 散金: 554
- 紅花: 4
- 帖子: 401
- 在線: 143.8小時
- 蟲號: 1495550
- 注冊: 2011-11-16
- 性別: GG
- 專業(yè): 發(fā)育生物學(xué)與生殖生物學(xué)
5樓2013-07-18 08:14:16
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 085410人工智能專碩317求調(diào)劑（0854都可以） +3 | xbxudjdn 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +8 | llllkkkhh 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
[考研] 一志愿985，本科211，0817化學(xué)工程與技術(shù)319求調(diào)劑 +7 | Liwangman 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué) 305求調(diào)劑 +3 | FY_yy 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +5 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 26研0 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)071000 329分求調(diào)劑 +3 | 我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | p asserby. 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +8 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 本科南京大學(xué)一志愿川大藥學(xué)327 +3 | 麥田耕者 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +3 | 5201314Lsy！ 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +6 | 邱gl 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] ［0860］321分求調(diào)劑，ab區(qū)皆可 +4 | 寶貴熱 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 26調(diào)劑/材料科學(xué)與工程/總分295/求收留 +9 | 2026調(diào)劑俠 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿山大07化學(xué) 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +3 | 李政瑩 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0817化學(xué)工程與技術(shù)考研312分調(diào)劑 +3 | T123 tt 2026-03-12 | 3/150 |
|