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小木蟲論壇-學(xué)術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » PCR
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PCR
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親們，最近在細(xì)胞中提取RNA,然后反轉(zhuǎn)錄，PCR，跑膠，遇到很多問題，想和各位大俠交流一下，不勝感激。 1.配置好的depc水泡過槍頭后是不是就不能用了，是一次性的嗎？ 2.直接用trizol加入到培養(yǎng)瓶中，感覺吹打半天，放置5分鐘后顯微鏡下看細(xì)胞還是很多貼壁，是不是還要繼續(xù)吹打啊，到底要什么細(xì)胞形態(tài)才是裂解好��？ 3.pcr用的act作上引和下引，目的條帶應(yīng)該是哪個啊，我不太清楚？ 4.下面是我做的一些pcr電泳圖，請大家?guī)臀铱纯矗遣皇菦]結(jié)果�。�  謝謝，謝謝啊 55℃PCR.jpg 45℃PCR.jpg IMG_20130712_205646.jpg IMG_20130712_205711.jpg [ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ] |
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loveskyzhou
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2樓2013-07-19 10:48:18
3樓2013-07-19 10:56:16
loveskyzhou
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4樓2013-07-19 16:22:48
5樓2013-07-20 08:49:41
孫啟亮
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小瞎子(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-20 12:07:00
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小瞎子(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-20 12:07:00
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致樓主： 首先你的膠咋這樣？溴化乙錠加多了吧 感覺你所有的引物都有問題，看引物濃度是不是太高才形成了那么多非特異擴(kuò)增，若不是，建議重新設(shè)計引物。 樓主的操作應(yīng)該不是很熟練，不知RNA質(zhì)量如何，你說的trizol法提RNA不知所用試劑購自哪里，若是inviitrigen的，裂解時間較長，大約15min左右。 提取的RNA要有質(zhì)量驗證才能反轉(zhuǎn)錄定量。 無酶水被污染后就不能用了 第一個圖中中間那條帶有可能是目的條帶，但跑的不太好，所以無法確定你的引物是否能用，確定目的條帶的方法就是看marker了，將目的條帶大小與marker對應(yīng)。 祝樓主實驗順利 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
6樓2013-07-20 11:03:06
送紅花一朵 |
嗯，我是剛開始做的，很不熟練啊，而且會的師姐畢業(yè)了，  染色我們都是跑完膠在那個溴化乙錠溶液中泡10-15分鐘，可能放的時間長了。trizol是天根的。我是要從組織中提rna，結(jié)果提了一次沒有提出來，老師讓我先從細(xì)胞中提取練習(xí)。我從小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中提rna，查的網(wǎng)上說10平厘米左右加1mltrizol，我就算著加了2ml，吹打時其實發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞并沒有下來。收集細(xì)胞應(yīng)該比較少，提完rna沒有定量，就按師姐的以前的量反轉(zhuǎn)錄了，最后pcr沒有目的條帶。那倆跑出來的是師姐以前提的rna反轉(zhuǎn)錄出的cdna，我的沒有。pcr，單位微升dd水 18.25 10x buffer 2.5 dNTP 2 上引和下引 各0.5（act-u act-d） cDNA 1 taq 0.3 謝謝你，能指點的幫忙指點下。  |
7樓2013-07-22 09:02:49
Sthunder
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小瞎子: 金幣+2, ★有幫助 2013-07-24 08:41:43
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1.配置好的depc水泡過槍頭后是不是就不能用了，是一次性的嗎？ DEPC水可以重復(fù)使用哈！ 2.直接用trizol加入到培養(yǎng)瓶中，感覺吹打半天，放置5分鐘后顯微鏡下看細(xì)胞還是很多貼壁，是不是還要繼續(xù)吹打啊，到底要什么細(xì)胞形態(tài)才是裂解好��？ trizol腐蝕性很強，加入后立即吹打（持續(xù)1 min足以），然后靜止15 min，一般情況想你可以看到管子里沒有明顯組織。但這不重要，得到rna后跑個膠，看下帶型就ok 3.pcr用的act作上引和下引，目的條帶應(yīng)該是哪個啊，我不太清楚？ act是常用的看家基因，但不知道你選用的引物具體設(shè)計在什么位點，一般我們都不擴(kuò)全長。 4.下面是我做的一些pcr電泳圖，請大家?guī)臀铱纯�，是不是沒結(jié)果��？ 明顯的那兩個帶不知道是否是你的act，如果是的話，你的模板應(yīng)該沒有問題。但你選用的pcr退火溫度蠻低，而且結(jié)果很彌散，根本沒明帶，所以建議拔高溫度試試看。 good luck |
8樓2013-07-22 10:51:20
9樓2013-07-22 15:35:51
hyc_charles
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10樓2013-07-22 18:31:35
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