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馮可新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
SYBR green 1 real-time PCR 結(jié)果分析
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這是我前兩天 做real-time PCR的圖。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前輩們能夠多多指點(diǎn)。 熒光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (買機(jī)器的時(shí)候帶的) 機(jī)器：Piko thermo real-time PCR 儀 目的片段大�。�500bp 反應(yīng)體系： thermo F-416 color flash 10μL 引物10μM 0.5μL 引物10μM 0.5μL DNA模板 （OD 260/280 =1.4） 5μL dd H2O 加到20μL 反應(yīng)條件： 95 ℃ 3min 94 ℃ 30s 53.6℃30s 72℃ 30s 40個(gè)循環(huán) 72℃ 7min 20℃ 永久 我有幾個(gè)疑問(wèn): （圖上我做的是兩個(gè)重復(fù)） 1，Cq 那張圖 ，擴(kuò)增曲線怎么是在5-10 個(gè)循環(huán)制見(jiàn)出現(xiàn)的，而且曲線還不光滑，沒(méi)看見(jiàn)有基線？ 正常是不是應(yīng)該在15個(gè)循環(huán)以后出現(xiàn)擴(kuò)增呢，而且15個(gè)循環(huán)之前應(yīng)該是基線啊。 2，溶解曲線那張圖，能看見(jiàn)有峰出現(xiàn)，但是為什么曲線不光滑呢？有很多的折線出現(xiàn)呢？ 3，不知道這兩個(gè)是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是應(yīng)該優(yōu)化引物濃度么？還是怎么回事？ 4，我的閾值是 419.5 這個(gè)閾值是自動(dòng)給出的。做real time的時(shí)候需要自己調(diào)節(jié)閾值么。 請(qǐng)前輩指教。謝謝了 Cq.png 溶解曲線.png |
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wangcheng2650
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2樓2013-07-22 21:29:16
馮可
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3樓2013-07-23 08:39:11
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4樓2013-07-24 09:49:57
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓上正解，我總結(jié)一下 1、模板濃度太高了，把模板稀釋一下，建議稀釋10000倍，定量體系中加入2ul模板就可以了，一般不要超過(guò)定量體系的10%，這樣Ct值大概 在19左右 2、引物濃度可以，一般終濃度在0.1uM-0.5uM之間，你的引物終濃度是0.25uM完全可以 3、你擴(kuò)增的片段確實(shí)有點(diǎn)長(zhǎng)了，建議減少到100-300bp之間，否則會(huì)影響擴(kuò)增效率 4、溶解曲線還可以，像樓上說(shuō)的那樣你可以跑個(gè)電泳看看，不過(guò)膠要配濃一點(diǎn)，比如2-3%之間的膠 |
5樓2013-10-17 12:27:36
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