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輕塵紫陌銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于手提質(zhì)粒質(zhì)量的一些問題
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| LZ最近在做質(zhì)粒手提，提到的質(zhì)粒最后用TE緩沖液溶解，用于PCR擴(kuò)增，其中出現(xiàn)了一個(gè)問題，就是質(zhì)粒的濃度和純度都挺好，濃度有2ug/ul，OD260/OD280=1.9多，用提取的質(zhì)粒直接進(jìn)行PCR效果較好，按理說這個(gè)濃度稀釋個(gè)10倍或者100倍擴(kuò)增效果應(yīng)該也不會(huì)太差，可是只有原始濃度的能擴(kuò)增出來，稀釋過的都不穩(wěn)定或者擴(kuò)增不出來，不知道是提取步驟除了問題還是怎么回事，注：稀釋用的還是TE，請(qǐng)教大神分析一下原因。 |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
輕塵紫陌: 金幣+30, ★★★★★最佳答案 2013-07-29 08:57:49
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我沒有看錯(cuò)吧，你用濃度是2μg/μl的質(zhì)粒直接PCR？如果真是這個(gè)濃度的質(zhì)粒你直接拿槍頭占一下跑電泳丟可以看到帶的，你需要稀釋至少1000倍。 我有疑問的是你的質(zhì)粒提出來后是否跑電泳觀察？提質(zhì)粒時(shí)是否加了RNase消化RNA？我懷疑是樣品中有大量RNA，干擾DNA定量，同時(shí)也會(huì)影響引物與模板結(jié)合。 |
2樓2013-07-26 01:22:12
輕塵紫陌
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3樓2013-07-26 11:27:53
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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RNase加的量沒錯(cuò)嗎？我看著很多啊。如果是40ug/ul加在6ml里面需要加0.24g的酶！ 一般質(zhì)粒PCR時(shí)只需要加10-100pg，所以剛開始的稀釋倍數(shù)是沒問題的。用TE稀釋也沒有關(guān)系，雖然TE里面的EDTA會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)有一點(diǎn)抑制，但你加的模板體積通常很少，所以EDTA的終濃度在PCR體系里是非常低的。我覺得問題主要是因?yàn)橄♂尯蟮腄NA不如在濃溶液里穩(wěn)定，經(jīng)反復(fù)凍融后質(zhì)量會(huì)有下降。所以稀釋后的樣品最好分裝一下。 |
4樓2013-07-26 15:08:24
輕塵紫陌
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5樓2013-07-29 08:57:33
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