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一株芽孢桿菌的DNA提取問題
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我都要哭了，提了兩次DNA什么都沒提出來，心好累��！ 這幾天在提實驗菌種的DNA，第一次除了Mark什么都沒有。于是我又換了一種方法，還是沒做出來，提了一種不知道是什么的DNA，愁得我啊。 只能把步驟列出來，請各位大神幫忙看看我是哪步出了問題。 該菌是芽孢桿菌，應該是革蘭氏陽性菌種。 第一次提步驟： 接一環(huán)斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30℃ 120rpm振蕩培養(yǎng)16h后,取1.5ml培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，以12,000r/min離心5min,去上清液,沉淀用500微升TE重懸菌體,加入1 mg/mL溶菌酶,37℃溫浴30min。加入1/10體積10%SDS和適量的蛋白酶K,混勻后置于37℃溫浴lh,然后用等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇抽提3次。取上清液加入兩倍體積的無水乙醇,4℃過夜沉淀DNA,12,000r/min離心15min,最后用70%乙醇洗滌1次,置于室溫自然干燥。將沉淀溶于適量的含10微升/mL RNaseA的TE中,于-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 第二次提步驟： 接一環(huán)斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,33℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)16h后，取1ml加入1.5ml的EP管中7500rpm 5min, 棄上清。細菌沉淀加入TE 567ul 重懸, 加入10%SDS 30ul 和20mg / ml 蛋白酶K 3ul，于37℃溫育1.4h, 加入5mol/ L NaCl 100ul混勻后, CTAB/ NaCl 80ul 溶液混勻, 于65℃溫育10min,補加氯仿/ 異戊醇至EP管1.5ml處,充分振蕩使呈乳濁液, 靜置2min 8000rpm離心5min。取700微升上清液轉入一個新管加等體積的酚/氯仿/ 異戊醇, 混勻, 靜置2min 8000rpm離心5min, 取500微升上清液再轉入一只新管中, 發(fā)現界面仍有少量蛋白膜，取300微升上清液再轉入一只新管中加等體積的酚/氯仿/ 異戊醇, 混勻, 靜置2min 8000rpm離心5min，發(fā)現界面無蛋白膜。取上清加入其0.6 體積異丙醇, 輕輕混合, 溫室靜止5min，離心5min, 棄上清, 加入1.0ml 70% 乙醇洗滌1min, 12000pm離心, 棄上清, 過夜自然晾干，將沉淀的DNA溶于100ul 的TE中，4℃兩天。 再跑電泳就出現圖片所看到的情況，不知道到底哪里出錯了。只有第一孔和最后一孔沒加樣，請各位大神幫忙看下。謝謝！ 未命名1.jpg [ Last edited by 放肆貓某人 on 2013-7-27 at 13:04 ] |
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3樓2013-07-27 21:11:08
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【答案】應助回帖
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放肆貓某人(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:05:06
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放肆貓某人(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:05:06
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用這個方法試試看！ DNA的提�。–TAB法）： 1、 樣品的研磨 （1） 植物樣品，稱取0.2g，于研缽中加入液氮迅速研磨，（盡量選擇新鮮嫩葉等易研磨的組織，但有時應根據具體實驗目的調整）； （2） 易于刮取的真菌和細菌可用新鮮的固體培養(yǎng)物，刮取培養(yǎng)物適量，加入65℃預熱的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮） （3） 不易刮取的真菌和細菌，可用液體培養(yǎng)物，離心收集菌體，盡量去除培養(yǎng)液（可用濾紙或紙巾吸干），對于分泌色素、多糖較多的菌株可用無菌水或生理鹽水清洗2~3次，轉入研缽，加入65℃預熱的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮）。 （樣品量一定要適中，過少，提取的DNA的量就少；過多，抽提buffer與樣品作用不充分，提取的DNA將含有較多雜質。研磨過程時間既不能過長又要充分磨勻） 2、 將65℃預熱的抽提buffer加入研缽或補充至600μl，稍研磨混勻，迅速轉入離心管中。 3、 于65℃水中溫育30min，期間不時搖動（上下翻轉）。（防止后續(xù)加入氯仿-異戊醇混合液時噴出） 4、 于冰上冷卻5min，加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），輕搖至溶液呈乳化狀態(tài)。 5、 12000g，冷卻離心5~10min。 6、 取上清，用等體積氯仿：異戊醇（24:1）抽提，12000g，冷凍離心5~10min。 7、 取上清，加入1/10體積的3mol/L NaAc及1.5~2體積預冷的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇，混勻，于-20℃冰箱中沉淀20min。 8、 12000g，冷凍離心10min，去除上清。 9、 沉淀加500μl 70%酒精，洗滌一次，冷凍離心5~10min，去除上清。（可倒置在紙巾上使液體流盡，勿使DNA沉淀倒出） 10、 晾干，在空氣中使核酸沉淀干燥。（干燥的標志為白色沉淀變?yōu)榘胪该骰蛲该鳎劜坏骄凭�。切勿過度干燥，否則DNA很難重新溶解） 11、 用適量ddH2O或TE with/without RNase（10μg/ml RNase A, pH 8.0）重新溶解核酸，振蕩，貯存于-20℃。（最好放置于37℃消解RNA 2~3hr） CTAB法提取總DNA溶液配制 一、2× CTAB抽提buffer CTAB 2%（m/v） Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0) 20mM NaCl 1.4 巰基乙醇 0.2%（v/v） 配制方法： 稱取CTAB 2g，NaCl 8.18g，量取1M Tris-HCl（pH 8.0）母液10ml，0.5M EDTA(pH 8.0)母液4ml，巰基乙醇0.2ml，加無菌ddH2O定容至100ml。于室溫保存，可在幾年內保持穩(wěn)定。 二、氯仿/異戊醇混合液 氯仿：異戊醇 24:1 三、TE緩沖液 Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0) 1mM 配制方法： 吸取0.5M EDTA(pH 8.0)母液0.2ml，1M Tris-HCl(pH 8.0)母液1ml，加ddH2O定容至100ml。保存于-20℃。（for TE with RNase：add RNase A 10mg/ml 母液0.1ml） 四、NaAc溶液 3M NaAc pH 5.2 配制方法：500ml ddH20中溶解40.81g NaAc•3H2O，用冰醋酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于4℃冰箱。 |
2樓2013-07-27 20:32:26
4樓2013-07-31 20:04:47
5樓2013-07-31 20:05:54
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