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fanwq258

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[交流] T載體連接不上去

自己擴(kuò)增的基因，連接T載體就是連不上，但是買(mǎi)載體時(shí)帶的插入片段可以連接上，這可該怎么辦呢？

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1樓 2013-08-05 09:53:35

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gyesang

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你是什么酶擴(kuò)出來(lái)的片段，如果是高保真酶的話，你考慮加A尾了嗎？

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2樓2013-08-05 13:35:34

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yuminzorro

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-10 14:19:36

你的pcr產(chǎn)物特異性如何，如果沒(méi)有非特異性條帶的話，不要純化直接連接，我2周前遇到和你類(lèi)似的情況，不純?cè)捴苯舆B就沒(méi)問(wèn)題，我用的是全日金的T1載體，4ul產(chǎn)物+1ul載體。你可以試試看，希望對(duì)你有幫助哦！

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17樓2013-08-09 22:45:32

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2樓: Originally posted by gyesang at 2013-08-05 13:35:34
你是什么酶擴(kuò)出來(lái)的片段，如果是高保真酶的話，你考慮加A尾了嗎？

不是高保真的酶，用的就是寶生物普通的ex taq

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3樓2013-08-05 14:51:24

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考慮下連接條件、片段大小及各種成分的量

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4樓2013-08-05 15:24:40

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flyhigh805

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amisking: 金幣+5, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲(chóng)子 2013-08-05 18:28:46
amisking: 回帖置頂 2013-08-05 18:28:48

你的目的片段大小是多少啊，太大的話連T載可能有點(diǎn)困難，但是只要優(yōu)化連接條件連上去應(yīng)該很容易的。應(yīng)嘗試提高PCR產(chǎn)物的濃度，可以取少量PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)如果大小正確的話剩下的PCR產(chǎn)物直接過(guò)膠回收的柱子，這樣得到的PCR產(chǎn)物濃度高，另外增加連接時(shí)間16℃過(guò)夜或4℃過(guò)夜。

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5樓2013-08-05 17:16:03

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引用回帖:

5樓: Originally posted by flyhigh805 at 2013-08-05 17:16:03
你的目的片段大小是多少啊，太大的話連T載可能有點(diǎn)困難，但是只要優(yōu)化連接條件連上去應(yīng)該很容易的。應(yīng)嘗試提高PCR產(chǎn)物的濃度，可以取少量PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)如果大小正確的話剩下的PCR產(chǎn)物直接過(guò)膠回收的柱子，這樣得到 ...

我的目的片段也就是800多，濃度在25ng/UL左右，買(mǎi)載體是帶的片段也就700多bp，濃度是50ng/UL，我就是按照自帶片段的濃度加的，可是就是連接不上

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6樓2013-08-05 18:43:10

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wswsjz

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7樓2013-08-05 19:00:09

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123n

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用的什么T載體？建議調(diào)整一下片段的濃度。。

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8樓2013-08-05 21:48:28

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追夢(mèng)草

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fanwq258(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-08 10:30:49

濃度再提高些，16度再多連會(huì)，會(huì)更有可能連上。我前一陣剛連上3900bp的片段，PCR產(chǎn)物膠回收柱濃度為400ng/ul，16度連了14h.

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9樓2013-08-05 23:02:13

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duoyidian

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fanwq258(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-08 10:30:57

一般是反應(yīng)的時(shí)間不夠，鏈接的條件的一般不會(huì)差多少的

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10樓2013-08-06 13:54:48

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joan198108

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gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-08 10:31:02

調(diào)整比例，延長(zhǎng)鏈接時(shí)間，考慮采用solution 1鏈接一下試試

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11樓2013-08-06 15:25:18

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54808455

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QIAGEN公司的研發(fā)專(zhuān)家發(fā)現(xiàn)，PCR引物5’端的堿基（也就是引物第一個(gè)堿基）的不同，會(huì)影響PCR產(chǎn)物的連接效率！檢查下你的引物。

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2013-08-07 18:28:12, 67.27 K

13樓2013-08-07 18:28:22

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yuguiyan

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真的假的��？你連了幾次失敗��？不就是DNA純化產(chǎn)物4微，T-VECTOR 1微，solution 1 1微嘛！So easy!

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14樓2013-08-07 21:42:22

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lqbzfun

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-08 10:30:39

趕緊去丁香園的試用中心申請(qǐng)個(gè)無(wú)縫克隆的試劑盒

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15樓2013-08-07 22:15:19

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cookee1981

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估計(jì)是沒(méi)有帶A尾

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16樓2013-08-08 10:43:32

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引用回帖:

6樓: Originally posted by fanwq258 at 2013-08-05 18:43:10
我的目的片段也就是800多，濃度在25ng/UL左右，買(mǎi)載體是帶的片段也就700多bp，濃度是50ng/UL，我就是按照自帶片段的濃度加的，可是就是連接不上...

建議按照我上面所說(shuō)的方法提高目的片段的濃度

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18樓2013-08-10 17:03:35

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zhaihong1983

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連不上是什么意思？是沒(méi)有菌落長(zhǎng)出來(lái)還是，有單菌落，但是鑒定后發(fā)現(xiàn)不是？
如果是沒(méi)有菌落，那你的PCR產(chǎn)物是什么酶P出來(lái)的，如果是高保真酶，你的PCR產(chǎn)物加T處理了嗎？沒(méi)加T肯定連不上。
如果有很多菌落，但是鑒定后不是，那你的PCR產(chǎn)物是做的膠回收嗎？如果沒(méi)做膠回收直接連的話，很容易連上的都是引物二聚體。

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19樓2013-08-16 13:18:23

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lifajun1976

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把PCR的產(chǎn)物濃度做大點(diǎn)，就沒(méi)問(wèn)題

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20樓2013-08-16 15:30:04

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xingjiuwcc

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PCR最后一步72℃7分鐘有嗎，沒(méi)有就不行了。。。。

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21樓2013-08-16 18:00:57

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lijia2054224

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fanwq258: 金幣+7 2013-08-22 15:36:24

現(xiàn)在已經(jīng)做出來(lái)了吧，哈哈，你那么聰明

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22樓2013-08-22 15:33:43

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9樓: Originally posted by 追夢(mèng)草 at 2013-08-05 23:02:13
濃度再提高些，16度再多連會(huì)，會(huì)更有可能連上。我前一陣剛連上3900bp的片段，PCR產(chǎn)物膠回收柱濃度為400ng/ul，16度連了14h.

想請(qǐng)問(wèn)您一下您的連接比例，我的目的片段3000-3500之間，連接做了一個(gè)月，沒(méi)有結(jié)果。各種體系，比例，連接時(shí)間都嘗試了，依然沒(méi)成功。請(qǐng)不吝指教。

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23樓2013-08-23 11:28:51

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追夢(mèng)草

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

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23樓: Originally posted by 隨緣棒棒糖 at 2013-08-23 11:28:51
想請(qǐng)問(wèn)您一下您的連接比例，我的目的片段3000-3500之間，連接做了一個(gè)月，沒(méi)有結(jié)果。各種體系，比例，連接時(shí)間都嘗試了，依然沒(méi)成功。請(qǐng)不吝指教。...

我也是連了好幾次才連上的。。。沒(méi)有計(jì)算連接比例，我覺(jué)得盡量提高PCR產(chǎn)物回收的濃度和16度連接時(shí)間，連上的可能性會(huì)變大。還有轉(zhuǎn)化最好做對(duì)照，保證感受態(tài)細(xì)胞，水浴鍋的溫度等都沒(méi)問(wèn)題，我們水浴鍋的溫度與我用溫度計(jì)測(cè)的差3度…我感覺(jué)連長(zhǎng)片段還要靠點(diǎn)運(yùn)氣，祝你好運(yùn)。

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回復(fù)此樓

24樓2013-08-24 11:37:51

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93wbj

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

引用回帖:

請(qǐng)問(wèn)你用的膠回收試劑盒是哪家的啊。我的膠回收序列太低了。

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回復(fù)此樓

25樓2016-05-19 18:33:09

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何何y

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17樓: Originally posted by yuminzorro at 2013-08-09 22:45:32
你的pcr產(chǎn)物特異性如何，如果沒(méi)有非特異性條帶的話，不要純化直接連接，我2周前遇到和你類(lèi)似的情況，不純?cè)捴苯舆B就沒(méi)問(wèn)題，我用的是全日金的T1載體，4ul產(chǎn)物+1ul載體。你可以試試看，希望對(duì)你有幫助哦！

你好，我也在用全式金的載體，目標(biāo)片段3000多，怎么也連不上。不知道什么原因

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回復(fù)此樓

26樓2017-12-14 11:55:41

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小熊長(zhǎng)大了

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26樓: Originally posted by 何何y at 2017-12-14 11:55:41
你好，我也在用全式金的載體，目標(biāo)片段3000多，怎么也連不上。不知道什么原因...

您好，請(qǐng)問(wèn)您TA克隆做出來(lái)了嗎？從年前做到現(xiàn)在一直沒(méi)出來(lái)

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回復(fù)此樓

27樓2018-03-09 14:57:02

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簡(jiǎn)單回復(fù)

piaofu12樓

2013-08-06 15:58 回復(fù)

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