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蒼云寶寶新蟲(chóng) (初入文壇)
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【求助！】有關(guān)超濾離心管的問(wèn)題 已有1人參與
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各位大蟲(chóng)好！ 先謝過(guò)大家了！ 最近在做一批蛋白 預(yù)實(shí)驗(yàn)中跑出來(lái)的蛋白條帶都很模糊，就是整條條帶彌散的很?chē)?yán)重（如圖） 感覺(jué)是因?yàn)闃悠分兄?lèi)什么的雜質(zhì)太多了的原因。 所以想能不能用超濾離心管進(jìn)行處理？ 不知道能不能��？~~？~~如果可以該用什么規(guī)格的牌子的呢···該怎么用呢？ 蛋白樣品量很少很少很少···估計(jì)目前也就5ml左右（各位見(jiàn)笑了···）真的是太少了··· 附圖： 8.19-1.jpg 8.22.jpg 8.26-UV.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare: 金幣+5, BioEPI+1 2013-09-04 08:24:41
silicare: 金幣+5, BioEPI+1 2013-09-04 08:24:41
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用超濾管除去雜蛋白有點(diǎn)不靠譜，不推薦，也很難實(shí)現(xiàn)，去除彌散就更不可能了（也許是我孤陋寡聞。。。） 譬如你的蛋白是40KD的，你用了50KD膜的超濾管，你的蛋白不是都會(huì)通過(guò)膜的，會(huì)有部分通過(guò)膜，部分沒(méi)有通過(guò)的，就算是10KD左右的雜蛋白也不會(huì)都通過(guò)膜的。 超濾管一般用來(lái)做蛋白的濃縮，或者更換緩沖液更多一點(diǎn)。提高蛋白純度很難。一般常用的牌子是millipore的。 明顯你的蛋白修飾比較多，不知道你的表達(dá)系統(tǒng)是什么，糖基化可能性高一點(diǎn)。你可以用糖基化酶進(jìn)行酶切，如果是糖基化的話(huà)，酶切后應(yīng)該會(huì)呈現(xiàn)出單一條帶的。 |
6樓2013-09-02 13:37:09
2樓2013-08-30 10:22:11
蒼云寶寶
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3樓2013-08-30 20:36:25
4樓2013-09-01 06:44:30
蒼云寶寶
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5樓2013-09-02 08:47:54
蒼云寶寶
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蒽蒽···那不知你覺(jué)得通過(guò)上面的SDS-PAGE的圖覺(jué)得目前蛋白是出現(xiàn)了什么問(wèn)題導(dǎo)致的這樣的結(jié)果呢？ 我是想不知道能不能通過(guò)超濾管做一個(gè)除雜神馬的···唔··· 做的是蜘蛛吐出來(lái)的消化液的電泳分析（預(yù)測(cè)是蛋白酶之類(lèi)的） 加過(guò)loading buffer 比例1:1（體積比） 上樣前煮沸5min，離心處理10000rpm/min，1min 上樣量在10ul-15ul不等，marker上樣5ul條帶正常。 電泳后染色為25%無(wú)水乙醇，10%冰醋酸，0.1%的考馬斯G-250混合，染色30min，固定液為25%異丙醇+10%冰醋酸混合，固定10min，脫色液為5%的無(wú)水乙醇，10%的冰醋酸混合，直至背景色褪去。 試劑配比： 1、分離膠緩沖液：Tirs 18.17g，SDS 0.4g 溶于水，用3mol/L HCl 調(diào)至pH8.8，加蒸餾水定容至100ml，其中Tris 為1.5mol/L，SDS為0.4% 2、濃縮膠緩沖液：Tris 6.0g，SDS 0.4g 溶于水，用3mol/L HCl 調(diào)至pH6.8，加蒸餾水定容至100ml，其中Tris為0.5mol/L，SDS為 0.4% 3、Arc/Bis：Arc 29.2g，Bis 0.8g 加蒸餾水溶解，定容至100ml，過(guò)濾后裝入棕色試劑瓶，4℃避光保存。 4、10%過(guò)硫酸銨：1g過(guò)硫酸銨溶于10ml去離子水中。 5、1*SDS-樣品緩沖液（10ml）：甘油 1.0g，SDS 0.2g，β-巰基乙醇 0.5ml，溴酚藍(lán) 0.012%（W/V） 加0.25mol/L Tris-HCl（pH 6.8)到10.0ml 6、電極緩沖液：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，溶于蒸餾水（pH 8.3），定容至1000ml。 |
7樓2013-09-02 19:40:05
8樓2013-09-02 20:49:20
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9樓2013-09-03 20:43:25
10樓2013-09-04 09:30:53
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