lily0423

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[求助] PCR產(chǎn)物彌散擴不出來怎么回事啊求教謝謝

這是提取的土壤DNA進(jìn)行PCR，是氨氧化細(xì)菌的功能基因擴增出來為什么是一片白？右側(cè)4個隱約可以看到目的基因但是很淡！我的是退火57度 30s，延伸 72度45秒

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1樓 2013-09-10 20:00:05

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hl16010921

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-12 09:57:46

1.在引物沒有試驗過，PCR條件沒確定的情況下，建議用梯度PCR儀確定退火溫度。
2.有陽性模板的情況下設(shè)立陽性對照。（成功的pCR結(jié)果，稀釋1000倍就可以）建議每次都設(shè)立。
3.模板的問題。（和樣品有關(guān)，有一定的可能）
4.引物設(shè)計和模板不匹配。因為引物可能是簡并引物，特異性較差�；蚍蛛x的菌株同標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列有所差異。
5.極端的解決辦法是膠回收PCR產(chǎn)物條帶。以其為模板再擴增。然后測序。（實在沒辦法時，可以嘗試）
或在PCR目的片段內(nèi)再設(shè)計一段截短的片段，以PCR結(jié)果為模板做二次PCR

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2樓2013-09-11 08:29:30

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2樓: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-11 08:29:30
1.在引物沒有試驗過，PCR條件沒確定的情況下，建議用梯度PCR儀確定退火溫度。
2.有陽性模板的情況下設(shè)立陽性對照。（成功的pCR結(jié)果，稀釋1000倍就可以）建議每次都設(shè)立。
3.模板的問題。（和樣品有關(guān)，有一定的可 ...

恩謝謝您的耐心。我想知道為什么點樣品的那些孔用到都是白色的？是非特異擴增還是什么？

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3樓2013-09-11 08:58:29

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應(yīng)該是非特異。不過特異性太差了，根本分不清條帶。。。先跑個退火的梯度吧。要不就做降落PCR試試。PCR條件優(yōu)化有時很費時間的。退火溫度有時差1度，天壤之別呀。還有下次這種圖可以用反轉(zhuǎn)片看，白背景黑條帶更清晰些。

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4樓2013-09-12 09:01:55

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4樓: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-12 09:01:55
應(yīng)該是非特異。不過特異性太差了，根本分不清條帶。。。先跑個退火的梯度吧。要不就做降落PCR試試。PCR條件優(yōu)化有時很費時間的。退火溫度有時差1度，天壤之別呀。還有下次這種圖可以用反轉(zhuǎn)片看，白背景黑條帶更清晰 ...

我這是dgge割膠下來的條帶，溶于水，用不帶夾子的引物擴增的，好像沒有擴增出來。后面要克隆測序的，哎，p了好多次都不行

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5樓2013-09-12 12:27:23

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-30 22:30:57

引用回帖:

5樓: Originally posted by lily0423 at 2013-09-12 12:27:23
我這是dgge割膠下來的條帶，溶于水，用不帶夾子的引物擴增的，好像沒有擴增出來。后面要克隆測序的，哎，p了好多次都不行
...

試試降落pcr，退火62度10個循環(huán)，55度25到30個循環(huán)試試。PCR條件不定時就是這樣的，我們曾經(jīng)遇到過挪了一次PCR儀，結(jié)果就不出了，移回原位就又出了，結(jié)果證明PCR儀的散熱情況影響PCR反應(yīng)。繼續(xù)吧。

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6樓2013-09-12 13:31:43

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