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冰凝草木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助從動(dòng)物體提取某種特定蛋白的方法
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| 最近老板讓我從動(dòng)物體內(nèi)提取某種蛋白，我說用活體采樣，然后粉碎組織后再用層析或者飽和硫酸銨析出的方法提取總蛋白。但是后續(xù)不知道該怎么做。而且老板說我之前的方法也不對(duì)。跪求前輩們賜教怎么做這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)兀袥]有相關(guān)的文獻(xiàn)可以推薦，不甚感激 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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用高濃度的鹽溶液變性后的蛋白質(zhì)一般用透析超濾處理除去鹽離子后能夠復(fù)性，也可以用分子篩層析除去鹽，順便根據(jù)分子量進(jìn)行分離。 從頭做分離注意幾個(gè)問題： 1.查文獻(xiàn)或者數(shù)據(jù)庫(kù)，確定蛋白分子量大小、等電點(diǎn)等性質(zhì)。 2.確定該蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的各個(gè)器官組織中的分布情況，在前處理時(shí)期一定要選用富含該蛋白質(zhì)的動(dòng)物的相應(yīng)的器官和組織用作粗分離的原料。 3.確定該蛋白質(zhì)是不是膜蛋白質(zhì)，是的話在粉碎組織后的抽提階段要加入表面活性劑把膜蛋白質(zhì)從膜上拉下來；不是膜蛋白，一般不必要用表面活性劑，至少不做電泳的話一般不要用表面活性劑增溶。 4.細(xì)分離階段根據(jù)蛋白質(zhì)的特征，安排不同的操作步驟，一般在細(xì)分離階段之前可先使用沉淀濃縮蛋白質(zhì)，比如鹽析、有機(jī)試劑沉淀、聚乙二醇沉淀等，獲得蛋白質(zhì)沉淀后要重新溶解，并且用過濾、超濾和透析除去沉淀劑。一般不要用強(qiáng)變性劑和加熱引起蛋白質(zhì)沉淀，以免變性無法逆轉(zhuǎn)。離子交換層析或者疏水層析，然后用凝膠層析，如果用能夠獲得該種蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的話，可以制備出抗體，則可用親和層析，或者能夠知道該蛋白的專一性配體的話（可以從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得資料）也可以使用親和層析，否則親和層析這步就做不了，只能在檢驗(yàn)該蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度不夠的話再做一輪或多輪離子交換層析或者疏水層析，然后用凝膠層析。當(dāng)然經(jīng)過了各種層析方法，純化出來的目地蛋白質(zhì)的濃度要比上樣前的濃度更低不少，不過濃縮到也不難，用超濾即可。 5.檢測(cè)純度，可以用溶解法或者M(jìn)S測(cè)定分子量或電泳。理論上電泳方法也可以用于分離提純，但是因?yàn)閺哪z中回收蛋白質(zhì)的話還要在純化目的蛋白質(zhì)，所以我不主張使用電泳方法也可以用于分離提純，尤其是若用SDS-PAGE要在上樣前加熱變性蛋白質(zhì)，能夠復(fù)性很難說。 6.對(duì)于分離提純的蛋白質(zhì)的所有操作一般適宜在零度到四度范圍內(nèi)，可以在有空調(diào)的房間進(jìn)行并將空調(diào)溫度調(diào)低，必要的話，須在有關(guān)設(shè)備周圍固著冰塊。 |
5樓2013-09-19 21:05:13
凌波麗
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| 1、查文獻(xiàn)，確定蛋白分子量大小、等電點(diǎn)等性質(zhì)；2、取活體組織，組織搗碎，離心取上清；3、將上清蛋白粗提液進(jìn)行分級(jí)硫酸銨沉淀，確定目的蛋白沉淀的硫酸銨飽和度；3、進(jìn)行離子交換層析、或者疏水層析，改變層析條件，分析目的蛋白純度；如果目的蛋白與雜蛋白差別比較大，可以過分子篩凝膠柱。 |
3樓2013-09-17 15:25:04
冰凝草
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Guide to Protein Purification(2nd edition)METHODS IN ENZYMOLOGY Vol-463 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6382232&fpage=1 |
8樓2013-09-19 22:36:26
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