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冰凝草木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助從動物體提取某種特定蛋白的方法
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| 最近老板讓我從動物體內(nèi)提取某種蛋白，我說用活體采樣，然后粉碎組織后再用層析或者飽和硫酸銨析出的方法提取總蛋白。但是后續(xù)不知道該怎么做。而且老板說我之前的方法也不對。跪求前輩們賜教怎么做這個實驗呢，有沒有相關(guān)的文獻可以推薦，不甚感激 |
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 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
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shenhaiwang
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冰凝草
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gyesang: 金幣+2, 專家考核！ 2013-09-20 00:22:48
冰凝草: 金幣+8, ★★★很有幫助 2013-09-19 21:33:35
gyesang: 金幣+2, 專家考核！ 2013-09-20 00:22:48
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用高濃度的鹽溶液變性后的蛋白質(zhì)一般用透析超濾處理除去鹽離子后能夠復性，也可以用分子篩層析除去鹽，順便根據(jù)分子量進行分離。 從頭做分離注意幾個問題： 1.查文獻或者數(shù)據(jù)庫，確定蛋白分子量大小、等電點等性質(zhì)。 2.確定該蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的各個器官組織中的分布情況，在前處理時期一定要選用富含該蛋白質(zhì)的動物的相應的器官和組織用作粗分離的原料。 3.確定該蛋白質(zhì)是不是膜蛋白質(zhì)，是的話在粉碎組織后的抽提階段要加入表面活性劑把膜蛋白質(zhì)從膜上拉下來；不是膜蛋白，一般不必要用表面活性劑，至少不做電泳的話一般不要用表面活性劑增溶。 4.細分離階段根據(jù)蛋白質(zhì)的特征，安排不同的操作步驟，一般在細分離階段之前可先使用沉淀濃縮蛋白質(zhì)，比如鹽析、有機試劑沉淀、聚乙二醇沉淀等，獲得蛋白質(zhì)沉淀后要重新溶解，并且用過濾、超濾和透析除去沉淀劑。一般不要用強變性劑和加熱引起蛋白質(zhì)沉淀，以免變性無法逆轉(zhuǎn)。離子交換層析或者疏水層析，然后用凝膠層析，如果用能夠獲得該種蛋白質(zhì)的標準品的話，可以制備出抗體，則可用親和層析，或者能夠知道該蛋白的專一性配體的話（可以從數(shù)據(jù)庫獲得資料）也可以使用親和層析，否則親和層析這步就做不了，只能在檢驗該蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度不夠的話再做一輪或多輪離子交換層析或者疏水層析，然后用凝膠層析。當然經(jīng)過了各種層析方法，純化出來的目地蛋白質(zhì)的濃度要比上樣前的濃度更低不少，不過濃縮到也不難，用超濾即可。 5.檢測純度，可以用溶解法或者MS測定分子量或電泳。理論上電泳方法也可以用于分離提純，但是因為從凝膠中回收蛋白質(zhì)的話還要在純化目的蛋白質(zhì)，所以我不主張使用電泳方法也可以用于分離提純，尤其是若用SDS-PAGE要在上樣前加熱變性蛋白質(zhì)，能夠復性很難說。 6.對于分離提純的蛋白質(zhì)的所有操作一般適宜在零度到四度范圍內(nèi)，可以在有空調(diào)的房間進行并將空調(diào)溫度調(diào)低，必要的話，須在有關(guān)設(shè)備周圍固著冰塊。 |
5樓2013-09-19 21:05:13
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