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[求助]
求提取水稻基因組的經(jīng)驗(yàn)
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| 最近在提取水稻的基因組，但是老是感覺提取的不好（我用RNAase處理了，RNA是沒有了，但是就是感覺提取的不怎么好�。�，因?yàn)橐黾谆�，對基因組的純度要求比較高！請問誰可以給我一些建議，最好做是自己提取了比較好的植物基因組，給點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)！本人將不勝感激！ |
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文庫構(gòu)建 
鐵蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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百博明創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動物肌肉組織和大腸桿菌培養(yǎng)物為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。 1. 從植物組織提取基因組DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。 二、設(shè)備 移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 三、試劑 1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方見第一章。 5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步驟： �。ㄒ唬┧居酌缁蚱渌棠究浦参锘蚪MDNA提取 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預(yù)熱。 2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時(shí)間長,DNA產(chǎn)量高), 不時(shí)搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。 9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。 10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。 11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。 12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。 13. 取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時(shí)取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質(zhì)量。 [注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。 �。ǘ�. 從李(蘋果)葉子提取基因組DNA 1. 取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。 2. 加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。 4. 同本節(jié)（一）中步驟3-13操作。 信息來源：BAC文庫構(gòu)建篩選專家 |
2樓2013-10-16 10:12:34
3樓2013-10-26 22:05:35
文庫構(gòu)建
鐵蟲 (小有名氣)
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毫無疑問，優(yōu)質(zhì)的基因組DNA對于基因組文庫構(gòu)建是至關(guān)重要的。研究者需要查閱文獻(xiàn)，通過經(jīng)驗(yàn)來選擇合適的基因組DNA分離方法，在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解，同時(shí)也要盡量保證DNA的純度。 二、處理基因組DNA 根據(jù)研究目的，研究者需要選擇合適的載體。不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求，研究者必須選擇合適長度的基因組DNA來構(gòu)建基因組文庫。 構(gòu)建黏�；蚪MDNA文庫，研究者需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機(jī)剪切DNA；接著用末端修復(fù)酶修復(fù)DNA，可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段，隨后使用百博明創(chuàng)的膠回收試劑盒回收DNA。構(gòu)建BAC基因組DNA文庫，研究者需要將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）來消化基因組DNA，然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb），隨后透析回收DNA。 需要注意： （1）電泳時(shí)，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準(zhǔn)確定位所需分子量的DNA。用百博明創(chuàng)試劑盒構(gòu)建黏粒文庫時(shí)，就可以直接采用文庫試劑盒內(nèi)的Control Insert DNA來做marker，既方便又準(zhǔn)確。 （2）電泳以后，應(yīng)該避免用紫外光照射目標(biāo)DNA，紫外光照射DNA會顯著降低克隆效率。解決方法：把marker所在的部分凝膠切下，在紫外燈下做好記號，然后以此為參考定位所需的片段。 （3）回收DNA的時(shí)候，應(yīng)該要避免過度離心，以防止DNA被剪切，降低文庫質(zhì)量。 來源:http://blog.sina.com.cn/s/blog_e4e0c7460101de44.html |
4樓2013-10-31 11:02:01
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