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lizhijiang木蟲 (著名寫手)
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[交流]
蛋白酶活性測定-酶譜法 已有3人參與
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酶譜法是測定蛋白酶活性的一種敏感方法之一，是用含蛋白酶作用底物的蛋白制成的分離膠，由于酶解作用使膠中相應(yīng)底物發(fā)生分解，致使酶解部分背景透明；也可檢測酶對casein或特異性底物作用的方法之一。 現(xiàn)將文獻和本人寫作中提到的酶方法做一簡要英文介紹。簡言之，與SDS-PAGE法有極其類似之處。區(qū)別在于，酶譜法：1、樣品不用煮沸。2、在分離膠中取出部分水溶解casein或特異性蛋白底物，制成含0.1或0.5%酶作用底物的分離膠（再在分離膠中加入所需的分離膠制備用水）。3、酶作用的底物嵌于分離膠中，因此與普通SDS-PAGE膠相比，膠空隙更小。因此，不可用marker，因為分離膠中遍布蛋白底物，染色后除酶解部位是透明顏色，而其他部分藍色。4、電泳后，孵育過程很重要，所以溶液配制中，尤其鈣離子激活酶活很重要；染色、脫色與sds-page差別不大。 如有疑問，可在回帖中交流。不當之處請指導(dǎo)。 Zymography The proteolytic zymography was performed in conjunction with SDS-PAGE according to the modified method of García-Carreño et al. and Laemmli. Ten percent separating gel was prepared in the presence of the final concentration of 0.1% casein or specific substrate, respectively. The enzyme, or specific enzyme were loaded on the 5% stacking gel and run electrophoresis. After electrophoresis, the gels were rinsed in distilled water and eluted for 40 min in a shaking water bath with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) containing 2.5% Triton X-100 and 5 mmol/L CaCl2. Subsequently, the casein- and specific substrate -zymography gel were washed with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) containing 5 mmol/L CaCl2 for 40 min and incubated with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) containing 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, and 0.02% NaN3 at 37 ℃ for 42 h. Then the gels were stained by Coomassie brilliant blue R-250 for 3 h and rinsed by the destainer containing 40% ethanol and 10% acetic acid. |
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