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xiaowo1127

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[交流] 求助PCR結(jié)果分析~~~

請問各位大俠，為什么我的PCR結(jié)果是這樣的。每次P完的結(jié)果都是有兩條條帶，我這樣的結(jié)果，應(yīng)該怎樣進(jìn)行改正才能P出完美的結(jié)果呢，請各位高手指教~~~
這個(gè)是我的PCR條件：
預(yù)變性94℃ 5min
30個(gè)循環(huán) 94℃ 30s、 55℃ 30s 、72℃ 30s
最后的延伸72℃ 5min
PCR反應(yīng)體系：20uL
Taq酶：0.1 uL
10*PCR buffer：2uL
dNTP：0.5uL
引物各0.5uL
DNA：0.5 uL
剩下的用雙蒸水補(bǔ)全

IMG_0421111111.JPG

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1樓 2013-09-17 20:23:13

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xiaowo1127

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3樓: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33
最下面的一條帶一般是引物二聚體或非特異帶。當(dāng)你需要某個(gè)目的片段時(shí)，引物的選擇是受到限制的，因此往往我們用的引物回存在形成二聚體、二級結(jié)構(gòu)等很多問題。我不明白你做pcr是為了獲得一個(gè)目的片段呢還是為了得到 ...

您好，謝謝你的回復(fù)，最好是兩個(gè)都能達(dá)到，我希望目的條帶能更亮一些，并且可以消除引物二聚體

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回復(fù)此樓

7樓2013-11-06 19:46:24

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yilunanxia

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:27
xiaowo1127: 金幣+1 2013-11-06 19:43:45

最下面一行可以無視存在，當(dāng)然如果樓主想要去除下面的條帶的話可以嘗試一下降低引物和dNTP的濃度。

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2樓2013-09-17 21:26:15

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bujunyang

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:35
xiaowo1127: 金幣+5 2013-11-06 19:44:05

最下面的一條帶一般是引物二聚體或非特異帶。當(dāng)你需要某個(gè)目的片段時(shí)，引物的選擇是受到限制的，因此往往我們用的引物回存在形成二聚體、二級結(jié)構(gòu)等很多問題。我不明白你做pcr是為了獲得一個(gè)目的片段呢還是為了得到一個(gè)perfect的圖片？

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3樓2013-09-17 21:33:33

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lvshilu

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:42

你好！我的幾點(diǎn)建議，敬請參考：
1. 調(diào)整模板的量，建議：稀釋10被，100倍；或者增加1倍，2倍，5倍，10倍。你的問題是目的條帶較淺，而不是后面的引物二聚體。
2. 做TM梯度，懷疑你的TM較高，但有時(shí)也說不準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)嘛做了才知道，可以做TM梯度。

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5樓2013-09-18 09:29:17

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簡單回復(fù)

廖志琴lzq4樓

2013-09-18 08:17 回復(fù)

引用回帖:

3樓: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33 最下面的一條帶一般是引物二聚體或非特異帶。當(dāng)你需要某個(gè)目的片段時(shí)，引物的選擇是受到限制的，因此往往我們用的引物回存在形成二聚體、二級結(jié)構(gòu)等很多問題。我不明白你做pcr是為了獲得一個(gè)目的片段呢還是為了得到 ...

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