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夏沐淺

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跑的是marker蛋白，12%的分離膠，沒有濃縮膠，跑著呈倒梯形，而且一共有十種蛋白的，我的出來了8條，15mA的電流，電壓開始只有60V，而且83*73*1的膠跑了1：40，時(shí)間也這么長(zhǎng)，這個(gè)是怎么回事��？
上面的圖是考染之后的，下面的是跑完之后拍的，

SDS-PAGE自制膠 zlp 2013-06-06.jpg

P6069319.JPG

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清淺

1樓 2013-06-07 15:52:24

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cicelyzh

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+2, 謝謝分享經(jīng)驗(yàn) 2013-06-08 08:58:42
夏沐淺: 金幣+5, ★有幫助 2013-06-08 13:56:42

我覺得你的marker跑成這樣算是不錯(cuò)的了。呈倒梯形主要可能是因?yàn)槟阒稽c(diǎn)了marker。如果在兩邊的空白泳道上點(diǎn)與marker同樣體積的上樣buffer來保持一下壓力，應(yīng)該可以解決這個(gè)問題。至于缺兩條帶的問題，問一下缺的什么分子量的帶？12%的膠上對(duì)有些分子量的蛋白可能分離效果差，跑不出來的。關(guān)于電壓電流的問題，你設(shè)置的是穩(wěn)壓還是穩(wěn)流跑？如果是穩(wěn)流，需要把電壓調(diào)高到200V以上，剛開始的時(shí)候電壓比較低，60V也算是正常的，隨著電泳過程電壓會(huì)逐漸升高的。跑1小時(shí)40分不是很久，根據(jù)你設(shè)置的電流，一般小膠差不多是這個(gè)時(shí)間。

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2樓2013-06-08 00:27:33

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引用回帖:

2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 00:27:33
我覺得你的marker跑成這樣算是不錯(cuò)的了。呈倒梯形主要可能是因?yàn)槟阒稽c(diǎn)了marker。如果在兩邊的空白泳道上點(diǎn)與marker同樣體積的上樣buffer來保持一下壓力，應(yīng)該可以解決這個(gè)問題。至于缺兩條帶的問題，問一下缺的什么 ...

缺的那兩個(gè)分子量是10kd和15kd的，雖然比較小，但是其他人做的12%的膠也跑出來了。
電泳我是恒流跑的，不是正常都在200V左右，所以電壓設(shè)置的是300V，開始是60V，跑完了也才100V，而且做得好的膠跑完的話大概一個(gè)小時(shí)。

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3樓2013-06-08 14:00:48

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
wizardfan: 金幣+2, 謝謝進(jìn)一步的幫助 2013-06-09 08:25:38

引用回帖:

3樓: Originally posted by 夏沐淺 at 2013-06-08 14:00:48
缺的那兩個(gè)分子量是10kd和15kd的，雖然比較小，但是其他人做的12%的膠也跑出來了。
電泳我是恒流跑的，不是正常都在200V左右，所以電壓設(shè)置的是300V，開始是60V，跑完了也才100V，而且做得好的膠跑完的話大概一個(gè) ...

10kd的帶有可能接近溴酚藍(lán)，所以看不太到也有可能。如果不是marker的質(zhì)量問題的話，應(yīng)該可以看到15kda的帶�？傮w來說你的marker其它帶不錯(cuò)。至于電壓?jiǎn)栴}，看你設(shè)的電流是多少了，如果是小膠10-15mA/gel電壓應(yīng)該是你說的那個(gè)范圍，時(shí)間也差不多。如果想跑快一些也是可以的，有人用20-25mA跑，不過可能會(huì)產(chǎn)生較多熱。

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4樓2013-06-08 23:51:17

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4樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 23:51:17
10kd的帶有可能接近溴酚藍(lán)，所以看不太到也有可能。如果不是marker的質(zhì)量問題的話，應(yīng)該可以看到15kda的帶�？傮w來說你的marker其它帶不錯(cuò)。至于電壓?jiǎn)栴}，看你設(shè)的電流是多少了，如果是小膠10-15mA/gel電壓應(yīng)該是 ...

mini膠，一般15mA，現(xiàn)在比較，現(xiàn)在比較糾結(jié)的是越到下邊的條帶越來越短，還變得很寬，條帶銳度和清晰度都較低。這個(gè)怎么回事？

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5樓2013-06-09 09:35:19

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4樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 23:51:17
10kd的帶有可能接近溴酚藍(lán)，所以看不太到也有可能。如果不是marker的質(zhì)量問題的話，應(yīng)該可以看到15kda的帶。總體來說你的marker其它帶不錯(cuò)。至于電壓?jiǎn)栴}，看你設(shè)的電流是多少了，如果是小膠10-15mA/gel電壓應(yīng)該是 ...

而且不是因?yàn)榕赃厸]加樣的原因，

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6樓2013-06-09 09:35:55

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
夏沐淺: 金幣+5, ★有幫助 2013-06-17 09:39:15
137167741: 金幣+2, 小木蟲交流，共同進(jìn)步~~ 2013-06-26 18:28:54

引用回帖:

5樓: Originally posted by 夏沐淺 at 2013-06-09 09:35:19
mini膠，一般15mA，現(xiàn)在比較，現(xiàn)在比較糾結(jié)的是越到下邊的條帶越來越短，還變得很寬，條帶銳度和清晰度都較低。這個(gè)怎么回事？...

普通SDS-PAGE在小分子量區(qū)域的分辨率變差屬于正�，F(xiàn)象。而且你做的至是12%的膠，10kD以下的蛋白不太可能分開的。如果做濃度大一些的膠或者梯度膠會(huì)有所改善。如果你要分小分子量的蛋白，最好跑tricine膠。
條帶從上至下有寬窄變化一般是由于樣品中離子強(qiáng)度和滲透壓的問題。如果旁邊點(diǎn)樣的話情況會(huì)好轉(zhuǎn)的。

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7樓2013-06-09 11:08:00

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7樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-09 11:08:00
普通SDS-PAGE在小分子量區(qū)域的分辨率變差屬于正�，F(xiàn)象。而且你做的至是12%的膠，10kD以下的蛋白不太可能分開的。如果做濃度大一些的膠或者梯度膠會(huì)有所改善。如果你要分小分子量的蛋白，最好跑tricine膠。
條帶從 ...

旁邊點(diǎn)樣了，還是這樣···

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8樓2013-06-17 09:39:34

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做得好些的條帶應(yīng)該是這樣的，就不知道我做的哪兒出問題了。

圖.jpg

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9樓2013-06-17 09:41:39

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137167741: 金幣+1, 小木蟲交流，共同進(jìn)步~~ 2013-06-26 18:29:04

引用回帖:

9樓: Originally posted by 夏沐淺 at 2013-06-17 09:41:39
做得好些的條帶應(yīng)該是這樣的，就不知道我做的哪兒出問題了。

圖.jpg
...

這個(gè)膠也有一定問題，條帶從上而下有些變寬。我不知道你的marker是哪個(gè)公司的，怎么做的預(yù)處理。我是把處理好的marker稀釋到與樣品同樣體積的loading buffer里。跑出來的帶是上下一樣寬。

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10樓2013-06-17 09:58:36

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