xiaowo1127

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[交流] 求助PCR結(jié)果分析~~~

請問各位大俠，為什么我的PCR結(jié)果是這樣的。每次P完的結(jié)果都是有兩條條帶，我這樣的結(jié)果，應(yīng)該怎樣進(jìn)行改正才能P出完美的結(jié)果呢，請各位高手指教~~~
這個是我的PCR條件：
預(yù)變性94℃ 5min
30個循環(huán) 94℃ 30s、 55℃ 30s 、72℃ 30s
最后的延伸72℃ 5min
PCR反應(yīng)體系：20uL
Taq酶：0.1 uL
10*PCR buffer：2uL
dNTP：0.5uL
引物各0.5uL
DNA：0.5 uL
剩下的用雙蒸水補全

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1樓 2013-09-17 20:23:13

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xiaowo1127

銅蟲 (初入文壇)

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引用回帖:

5樓: Originally posted by lvshilu at 2013-09-18 09:29:17
你好！我的幾點建議，敬請參考：
1. 調(diào)整模板的量，建議：稀釋10被，100倍；或者增加1倍，2倍，5倍，10倍。你的問題是目的條帶較淺，而不是后面的引物二聚體。
2. 做TM梯度，懷疑你的TM較高，但有時也說不準(zhǔn)，實驗 ...

是的，您說的很對，我的條帶亮度確實是不夠，我做了很多次，每次出現(xiàn)的問題是不一樣的，我換了條件和反應(yīng)的用量，可是得到的條帶還是不是很滿意，給您看一下，請您幫我分析一下好嗎，我怎樣可以把條帶上面的亮度除去
反應(yīng)條件 94℃  9min  預(yù)變性
         94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)
         最后在72℃延伸7min
體系20uL體系
Taq酶為0.4μl
dNTP mixture（0.25mM）為2μl
10×PCR Buffer (Mg2+Plus)為2.5μl，
模板（土壤DNA）為5μl，
正向引物(10μM)為1μl，
反向引物（10μM）為1μl，
補全ddH2O為13.1μl

IMG_7602.JPG

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9樓2013-11-06 19:56:23

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yilunanxia

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:27
xiaowo1127: 金幣+1 2013-11-06 19:43:45

最下面一行可以無視存在，當(dāng)然如果樓主想要去除下面的條帶的話可以嘗試一下降低引物和dNTP的濃度。

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2樓2013-09-17 21:26:15

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bujunyang

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:35
xiaowo1127: 金幣+5 2013-11-06 19:44:05

最下面的一條帶一般是引物二聚體或非特異帶。當(dāng)你需要某個目的片段時，引物的選擇是受到限制的，因此往往我們用的引物回存在形成二聚體、二級結(jié)構(gòu)等很多問題。我不明白你做pcr是為了獲得一個目的片段呢還是為了得到一個perfect的圖片？

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3樓2013-09-17 21:33:33

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lvshilu

新蟲 (小有名氣)

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-18 10:23:42

你好！我的幾點建議，敬請參考：
1. 調(diào)整模板的量，建議：稀釋10被，100倍；或者增加1倍，2倍，5倍，10倍。你的問題是目的條帶較淺，而不是后面的引物二聚體。
2. 做TM梯度，懷疑你的TM較高，但有時也說不準(zhǔn)，實驗嘛做了才知道，可以做TM梯度。

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5樓2013-09-18 09:29:17

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簡單回復(fù)

廖志琴lzq4樓

2013-09-18 08:17 回復(fù)

引用回帖:

3樓: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33 最下面的一條帶一般是引物二聚體或非特異帶。當(dāng)你需要某個目的片段時，引物的選擇是受到限制的，因此往往我們用的引物回存在形成二聚體、二級結(jié)構(gòu)等很多問題。我不明白你做pcr是為了獲得一個目的片段呢還是為了得到 ...

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