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SDS-page 原核表達蛋白 電泳條帶彌散 已有6人參與
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求助，最近做了N塊膠，有15%的分離膠，也有5%-20%的梯度膠跑出來的蛋白不成條帶？？以前不這樣啊？ 菌液IPTG誘導完，離心沉淀菌體，PBS重懸，加4XSDS上樣緩沖液（終濃度為1X）煮沸5min，13000rpm離心12min，在4℃保存，第二天電泳。 ![\"SDS-page](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2013/1006/w158h1911237_1381061914_706.jpg#opennewwindow\")  ![\"SDS-page](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2013/1006/w102h1911237_1381061927_393.jpg#opennewwindow\") |
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 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 | 核酸生物學實驗經(jīng)驗 |
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xiaoche
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2樓2013-10-06 23:07:08
藍冰天山
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-10-07 21:43:40
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SDS電泳帶彌散和拖尾的原因和改進措施(2013-10-7) 1.原因一：上樣量過多，應該減少上樣量。對策：加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15µL（即2-10µg蛋白質(zhì)）。如果樣品很稀上樣量可以達到100µL。 2.原因二：樣品溶解不完全。 對策： （1）樣品應該充分溶解：保持各種蛋白質(zhì)樣品和Marker在上樣前能夠充分溶解，上樣前最好離心一下，實在溶解不掉的顆粒就去掉。 (2)可以根據(jù)分子量標準的蛋白質(zhì)試劑盒的要求加入樣品溶解液；如果是自行配置標準和未知樣品，按照0.5-1.0mg/L樣品溶解液。溶解后，將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，蓋上蓋子（可以在蓋子處加上卡子）后在110度沸水中水浴加熱3分鐘（可以在薄泡沫塑料板上鉆出幾個與Eppendorf管直徑形同的圓洞，Eppendorf管放下去直到蓋子邊緣約束不能再往下為止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管體大部分的那一面放入沸水浴鍋中，薄泡沫塑料板自然飄在沸水表面，便于取用和加熱，也可避免沸水濺起�？梢砸慌鷮τ诙鄠�Eppendorf管進行不同時間的沸水浴。不要把Eppendorf管扔進沸水浴鍋中，蓋子可能會被沖開），而后在室溫下冷卻待用。如果較長時間不用，則將樣品放入零下20度冰箱中儲存，需用時在取出后使用前在110度沸水中加熱3分鐘室溫冷卻后再上樣，以去掉樣品蛋白質(zhì)中的亞穩(wěn)態(tài)聚合體。 （3）改變樣品緩沖溶液使得樣品能夠充分溶解，SDS 用量要充分。 樓主的圖看不見，更具樓主的情況加上一條： 3.原因三.原核細胞的表達產(chǎn)物發(fā)生了降解或者提前終止了翻譯。 |
4樓2013-10-07 21:20:59
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dongmings
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