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山水88木蟲(chóng) (正式寫手)
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[求助]
PCR片段量少求教
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由于要做重組，所以引物設(shè)計(jì)比較長(zhǎng)，50bp同源序列加上20bp PCR引物，但是PCR片段量一直特別少，試了不同的恒定溫度或者每循環(huán)降0.5度的方法，體系中也加了DMSO，結(jié)果都不理想，如圖是8個(gè)不同的恒定溫度結(jié)果，中上部亮度漸弱為目的片段，下面就是引物二聚體了，目前體系是2XTaq酶 10ul,質(zhì)粒2ul,引物1ulX2，DMSO 1ul，ddH2O 5ul.求教各位大俠還有什么可以改進(jìn)的地方呢？還望不吝賜教，鄙人感激不盡！�。�！ 1.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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首先第一點(diǎn)：你用的是20ul體系，我記得TAQ 酶的說(shuō)明書上建議的50ul體系是 25ul mix ,1ul引物（20uM）,模板（0.1ng-10ng)/ul 加入1ul 。所以從你可以按著標(biāo)準(zhǔn)體系再重新配制一下。 第二，你的引物是長(zhǎng)引物，在PCR的最初的循環(huán)中 ，只有與模板互補(bǔ)的那20bp 需要進(jìn)行退火。所以如果你的退火溫度是按著整個(gè)引物去設(shè)計(jì)，那是不合理的。 第三，不同的酶擴(kuò)增的效率也不一樣。 我給你的建議是 1.重新調(diào)整體系。2. PCR先進(jìn)行6個(gè)低溫的循環(huán)，溫度按照那20堿基去計(jì)算。3. 可以換其他的酶 ，比如KOD系列的 |
4樓2013-10-12 16:13:47
cicelyzh
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3樓2013-10-12 10:01:10
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5樓2013-10-12 17:08:42
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