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子瀟楊帆金蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助�。�！篩選分子標(biāo)記體系中的PCR問(wèn)題
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我采用SCoT分子標(biāo)記法對(duì)某個(gè)植物材料的擴(kuò)增體系進(jìn)行篩選優(yōu)化，建立了體系所需的5因素（模板，鎂離子，dNTP，引物，Taq酶）4水平共16個(gè)組合的梯度篩選體系，如下所列： Mg2+濃度/ mmol /L dNTPs濃度/mmol /L Taq 聚合酶濃度/U 引物濃度/μmol/ L 模板DNA 濃度/ng/μl 1 1.5 0.20 0.5 0.5 1.0 2 2.0 0.25 1.0 0.6 1.5 3 2.5 0.30 1.5 0.7 2.0 4 3.0 0.35 2.0 0.8 2.5 擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 32個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在0.8 %瓊脂糖凝膠，l×TAE緩沖液條件下電泳， 染色后觀察。電泳條件為電壓120，電流190，功率40 現(xiàn)在連續(xù)嘗試了4次，結(jié)果每次的電泳圖全是很嚴(yán)重的彌散狀，有的連MARKer都彌散了，看不清楚，請(qǐng)問(wèn)懂這方面的師兄師姐哪位能給指點(diǎn)一下，我的問(wèn)題出在哪兒？已經(jīng)有各因素的濃度梯度設(shè)置了，是不是只能從擴(kuò)增程序的改變上先嘗試解決彌散的問(wèn)題，比如提高退火溫度，減少循環(huán)數(shù)等？這兩個(gè)措施我已經(jīng)嘗試過(guò)了，然后效果并不好，還是彌散。。。是不是模板的質(zhì)量不好，也會(huì)有彌散的情況出現(xiàn)？哪位前輩做過(guò)這類實(shí)驗(yàn)的能給指點(diǎn)指點(diǎn)吧？實(shí)在不知道問(wèn)題出在哪兒，也不知道該怎樣改進(jìn)，不知道該怎樣向下進(jìn)行下一步試驗(yàn)了。。。。。。謝謝各位了�。。。。�！ 11-7（篩）1.jpg 11-7（篩2）1.jpg |
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2樓2013-11-10 11:18:33
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子瀟楊帆
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