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Marker條帶問(wèn)題及引物二聚體 已有1人參與
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 急急急！！各位親，求幫幫忙，馬上要做QPCR了，可現(xiàn)在用普通PCR驗(yàn)證為QPCR設(shè)計(jì)的引物現(xiàn)在都是出了問(wèn)題，怎么辦呢�。。。�！ 1，天根DL2000 Marke為2000bp，如圖可看到Marker上面三條帶有彎曲，而且彌散厲害，是什么原因呢？。 2，設(shè)計(jì)的引物，貌似都有二聚體？還是發(fā)卡結(jié)構(gòu)？分別用下面八對(duì)引物跑的魚(yú)的肝和脂肪組織（圖3，肝跑出來(lái)，脂肪組織織沒(méi)跑出來(lái)）。 3，這引起引物目的基因的片段都是，101-138之間的，但在，1，3，5跑道有大于遠(yuǎn)目的基因的片段，為什么？ 4，有會(huì)oligo軟件或NCBI在線BLAST的，能否幫比對(duì)下是不是引物的問(wèn)題。 C1F GGCAACAGCATCCATTCATT 20 2 HAP C1R TGCGTGTGGTGTTGAATATCC 21 2 HAP C2F TCCTAGATGACCCTTCACCTC 21 2 HAP C2R CCAAAGAGCGTTTATTGACCC 21 2 HAP C3F GCCATTCATTCTATCATGCTG 21 2 HAP C3R TCGTGTTGAACATACGCTCGT 21 2 HAP C4F AAGGGACGTTACTTCAAGGTG 21 2 HAP C4R TCCGACTTGTCTGCCAAGAT 20 2 HAP H1F CTGGATGTCCATTTCTGGAA 20 2 HAP H1R AAGGTCAAAGGTCGCAGGA 19 2 HAP H2F TCCACCATCAGCGCACAT 18 2 HAP H2R AGCCCCAGGGAAAGAGAGATA 21 2 HAP ATaF GGAATCTCTCTCACCCGAGTT 21 2 HAP ATaR AATGATGCCACAGTACACTGG 21 2 HAP ATbF CCGAGTTACAGACGGAGAAAA 21 2 HAP ATbR TGATGCCACAGTACACTGGGA 21 2 HAP 3.jpg |
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2樓2013-12-08 16:28:17
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你用的cDNA為模板P的？有大片段可能是gDNA沒(méi)消化干凈，而且引物跨內(nèi)含子。 這里有個(gè)網(wǎng)絡(luò)版的引物分析，你自己檢查一下情況。 http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ |
3樓2013-12-08 16:52:40
4樓2013-12-09 16:16:20
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謝謝,用takala去DNA試劑盒再反轉(zhuǎn)的，我的引物是跨外顯子設(shè)計(jì)的（引物用跨外顯子actin跑，均只跑出二聚體）。 1，共有兩個(gè)預(yù)測(cè)亞型，然后6個(gè)外顯子，我用的有第二個(gè)外顯子和第三個(gè)外顯子，第四和第五個(gè)外顯子。 2，知部分序列，共有10個(gè)外顯子，本引物設(shè)計(jì)采用第三和第四個(gè)外顯子來(lái)設(shè)計(jì)。第二對(duì)引物以第四個(gè)和第五個(gè)外顯子來(lái)設(shè)計(jì)。 3，共有9個(gè)外顯子，我測(cè)序與相近物種，第二和第三個(gè)外顯子相似度高，用來(lái)設(shè)計(jì)。 4，網(wǎng)張引物分析好像用不了，老師你是用過(guò)嗎？ |
5樓2013-12-09 17:20:22
jurkat.1640
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-12-24 08:25:39
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引物二聚體是正常的，引物過(guò)多或者沒(méi)有擴(kuò)增出目的帶時(shí)可以看見(jiàn)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Tm值如果不是太高（30℃以下）問(wèn)題不大。 適當(dāng)?shù)囊锒垠w和發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以減少非特異性擴(kuò)增，如果引物不形成二聚體和適當(dāng)?shù)陌l(fā)夾結(jié)構(gòu)反而容易擴(kuò)增出非特異性帶。 |
6樓2013-12-09 17:49:30
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8樓2013-12-09 18:35:53
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用1%的膠試試看，引物二聚體一般情況下多多少少都會(huì)有，我覺(jué)得這個(gè)影響并不是非常大啊。 你可以多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物一起合成，然后一起P了看看哪個(gè)效果好，有時(shí)候引物二聚體去不掉但是相對(duì)你的產(chǎn)物來(lái)說(shuō)非常淡，那樣的話我認(rèn)為是不影響你的下步實(shí)驗(yàn)的。 marker的上樣量有點(diǎn)大哦，我們一般只上1UL的marker，這個(gè)膠跑得有點(diǎn)……建議你換新的緩沖液，重新做膠，再跑一次。 |
10樓2013-12-10 21:01:41
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