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山水88木蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教做過基因染色體整合的大俠們
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我現(xiàn)在想做基因染色體整合，看文獻中所整合的基因有不同形式的。有的是說所整合的基因帶的是自有啟動子，但我不明白基因的自有啟動子是指什么，ATG開始就可以了還是說前面有一段課本上所說的-35序列什么的？還有的是基因前面加了Ptac或或者T7等啟動子，那這些基因是怎么表達的呢，需要IPTG誘導(dǎo)什么的呢還是說不用誘導(dǎo)就可以自己表達了？ 總的就是我想知道我要整合基因是只將該基因ATG到TAA之間的序列整合上去還是說ATG前面應(yīng)該有什么序列才能保證基因能夠正常表達？分子生物學(xué)沒學(xué)好，還望各位不吝賜教，謝謝大家了！ |
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cicelyzh
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啟動子是指DNA序列中RNA聚合酶識別并結(jié)合的序列。任何基因的表達都是需要有啟動子的。ATG是起始密碼子，不是啟動子。原核生物的啟動子是指ATG上游-10和-35的特定序列。啟動子有很多，分為誘導(dǎo)型和組成型。常用于做表達的啟動子是誘導(dǎo)型的。你說的tac啟動子是誘導(dǎo)型的，T7是組成型的。 整合基因到染色體的目的是做表達的話，一般要根據(jù)需要加啟動子，可以用強啟動子，或者誘導(dǎo)啟動子（誘導(dǎo)啟動子往往和宿主有關(guān)）。只克隆起始密碼子到終止密碼子的話，基因不會表達或者以極低水平的本底表達，通常不能用來研究基因功能。 |
2樓2013-12-10 05:47:06
山水88
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非常感謝您的指導(dǎo)！我還是有以下疑問： 1、我是往大腸桿菌染色體上添加基因，如果是用基因自帶啟動子，應(yīng)該就是加上它前面的-10、-35特定序列，也就是大概50bp就可以了吧。但是這有個問題，因為我們是做工程菌，就是想過表達其中幾個關(guān)鍵基因，我看過有的文章介紹用質(zhì)粒載體做表達可能沒有在染色體上整合來的穩(wěn)定，那僅僅是給它單純的在染色體上添加一個基因拷貝數(shù)效果會好嗎？ 2、你說的T7啟動子是組成型啟動子，但是pET載體質(zhì)粒中的表達都要IPTG誘導(dǎo)的，這是怎么回事呢？如果我把要表達的基因ATG前面加上T7啟動子序列然后放進染色體中，它會表達嗎或者仍然需要IPTG誘導(dǎo)表達？因為我看到T7啟動子需要T7 RNA 聚合酶的作用，用DE3化的菌株可以解決這個問題嗎？ 3、另外就是想請您幫我推薦幾種可以直接在染色體上表達的強啟動子。 問題比較多，再次感謝！ |
3樓2013-12-10 09:18:18
cicelyzh
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1.. -10和-35是狹義上的啟動子，一般的啟動子要包含更長的序列。如果你要克隆一個基因的啟動子，不是50bp就能解決的。整合到染色體上的基因比在質(zhì)粒上表達穩(wěn)定，但是由于拷貝數(shù)的限制，同樣的啟動子表達量可能不如在質(zhì)粒上高。有研究表明增加拷貝在染色體上可以提高表達效果。 2. T7啟動子本身不是誘導(dǎo)型的。T7啟動子只能被T7 RNA聚合酶識別，而這個酶在原始的大腸桿菌里是沒有的，一些工程菌在染色體上整合了T7 RNA聚合酶基因，而這個基因是由lac operon調(diào)控的，因而T7啟動子下游的基因可以被IPTG誘導(dǎo)。DE3是表達蛋白常用的工程菌株，可以識別T7啟動子。 3. 做大腸桿菌表達的話，你提到過的T7和tac都是常用的強啟動子。 |
4樓2013-12-10 15:13:56
山水88
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5樓2013-12-10 16:36:14
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1. 有一些分析基因啟動子的軟件和online程序，把序列輸進去就可以分析。原核生物啟動子一般在ATG上游的數(shù)百bp之內(nèi)，保守一些可以克隆1kb。 2. DE3是工程菌株，染色體上有溶原噬菌體整合的T7 RNA聚合酶了，而且是用lacI抑制的，所以pET系列的表達載體在DE3里是誘導(dǎo)表達的。 3. Ptac是一個雜交啟動子，被lacI抑制，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達。Tac啟動子是誘導(dǎo)表達的代表，可以通過誘導(dǎo)劑量來控制表達量，盡管完全抑制時可能有少許本底表達。 基因表達用誘導(dǎo)啟動子的優(yōu)勢很明顯。因為有些基因產(chǎn)物對宿主有害，在強啟動子大量表達下會抑制菌體生長，甚至死亡。 |
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山水886樓2013-12-11 09:14:18
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7樓2013-12-11 12:10:53
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您好，抱歉又打擾到您了！ 我現(xiàn)在整合做成功了，菌株是自己DE3化的，然后將pET載體上的基因連同T7啟動子和終止子（啟動子后有l(wèi)ac）一起整合入DE3化的菌株，結(jié)果我要的目的產(chǎn)物產(chǎn)量有了提高，但是提高量不是很多，而且整合后的菌株不加IPTG誘導(dǎo)劑才會有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的產(chǎn)量幾乎與原菌株無差別。跑SDS-PAGE圖兩者都沒有明顯蛋白表達量增多。那么請問出現(xiàn)這種現(xiàn)象是為什么呢？按理說應(yīng)該是添加IPTG后才會表達更多吧，那么如果 這樣是不是可以認(rèn)為我現(xiàn)在的提高是一種基底表達，而真正的表達條件我可能還沒有摸索清楚，所以產(chǎn)量反倒因為IPTG的毒性而不會提高呢？ 再次感謝！ |
8樓2014-05-28 22:30:52
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9樓2014-07-02 15:45:20
山水88
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10樓2014-07-02 17:40:01
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