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山水88木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
請(qǐng)教做過(guò)基因染色體整合的大俠們
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我現(xiàn)在想做基因染色體整合，看文獻(xiàn)中所整合的基因有不同形式的。有的是說(shuō)所整合的基因帶的是自有啟動(dòng)子，但我不明白基因的自有啟動(dòng)子是指什么，ATG開(kāi)始就可以了還是說(shuō)前面有一段課本上所說(shuō)的-35序列什么的？還有的是基因前面加了Ptac或或者T7等啟動(dòng)子，那這些基因是怎么表達(dá)的呢，需要IPTG誘導(dǎo)什么的呢還是說(shuō)不用誘導(dǎo)就可以自己表達(dá)了？ 總的就是我想知道我要整合基因是只將該基因ATG到TAA之間的序列整合上去還是說(shuō)ATG前面應(yīng)該有什么序列才能保證基因能夠正常表達(dá)？分子生物學(xué)沒(méi)學(xué)好，還望各位不吝賜教，謝謝大家了！ |
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山水88
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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非常感謝您的指導(dǎo)！我還是有以下疑問(wèn)： 1、我是往大腸桿菌染色體上添加基因，如果是用基因自帶啟動(dòng)子，應(yīng)該就是加上它前面的-10、-35特定序列，也就是大概50bp就可以了吧。但是這有個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槲覀兪亲龉こ叹�，就是想過(guò)表達(dá)其中幾個(gè)關(guān)鍵基因，我看過(guò)有的文章介紹用質(zhì)粒載體做表達(dá)可能沒(méi)有在染色體上整合來(lái)的穩(wěn)定，那僅僅是給它單純的在染色體上添加一個(gè)基因拷貝數(shù)效果會(huì)好嗎？ 2、你說(shuō)的T7啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，但是pET載體質(zhì)粒中的表達(dá)都要IPTG誘導(dǎo)的，這是怎么回事呢？如果我把要表達(dá)的基因ATG前面加上T7啟動(dòng)子序列然后放進(jìn)染色體中，它會(huì)表達(dá)嗎或者仍然需要IPTG誘導(dǎo)表達(dá)？因?yàn)槲铱吹絋7啟動(dòng)子需要T7 RNA 聚合酶的作用，用DE3化的菌株可以解決這個(gè)問(wèn)題嗎？ 3、另外就是想請(qǐng)您幫我推薦幾種可以直接在染色體上表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。 問(wèn)題比較多，再次感謝！ |
3樓2013-12-10 09:18:18
cicelyzh
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啟動(dòng)子是指DNA序列中RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的序列。任何基因的表達(dá)都是需要有啟動(dòng)子的。ATG是起始密碼子，不是啟動(dòng)子。原核生物的啟動(dòng)子是指ATG上游-10和-35的特定序列。啟動(dòng)子有很多，分為誘導(dǎo)型和組成型。常用于做表達(dá)的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。你說(shuō)的tac啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的，T7是組成型的。 整合基因到染色體的目的是做表達(dá)的話，一般要根據(jù)需要加啟動(dòng)子，可以用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者誘導(dǎo)啟動(dòng)子（誘導(dǎo)啟動(dòng)子往往和宿主有關(guān)）。只克隆起始密碼子到終止密碼子的話，基因不會(huì)表達(dá)或者以極低水平的本底表達(dá)，通常不能用來(lái)研究基因功能。 |
2樓2013-12-10 05:47:06
cicelyzh
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1.. -10和-35是狹義上的啟動(dòng)子，一般的啟動(dòng)子要包含更長(zhǎng)的序列。如果你要克隆一個(gè)基因的啟動(dòng)子，不是50bp就能解決的。整合到染色體上的基因比在質(zhì)粒上表達(dá)穩(wěn)定，但是由于拷貝數(shù)的限制，同樣的啟動(dòng)子表達(dá)量可能不如在質(zhì)粒上高。有研究表明增加拷貝在染色體上可以提高表達(dá)效果。 2. T7啟動(dòng)子本身不是誘導(dǎo)型的。T7啟動(dòng)子只能被T7 RNA聚合酶識(shí)別，而這個(gè)酶在原始的大腸桿菌里是沒(méi)有的，一些工程菌在染色體上整合了T7 RNA聚合酶基因，而這個(gè)基因是由lac operon調(diào)控的，因而T7啟動(dòng)子下游的基因可以被IPTG誘導(dǎo)。DE3是表達(dá)蛋白常用的工程菌株，可以識(shí)別T7啟動(dòng)子。 3. 做大腸桿菌表達(dá)的話，你提到過(guò)的T7和tac都是常用的強(qiáng)啟動(dòng)子。 |
4樓2013-12-10 15:13:56
山水88
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