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愛吃小蘋果新蟲 (初入文壇)
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[求助]
連接不成功，跪求指導(dǎo)！ 已有4人參與
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| 最近在做構(gòu)建，但是連接連了很久都沒連上，一端是平末端，一段是粘性末端，沒別的位點(diǎn)可以選了，只能用這個(gè)。用的Takara的T4連接酶，連接是按摩爾比加的，1：3，1：5，1：10都用過，還加了PEG4000，4°、16°過夜都試過，平板上會(huì)有很多菌落，但是菌落PCR一直都沒有條帶，應(yīng)該都試載體自連，片段3000bp，載體4900bp。哪位大神做過類似的，麻煩支支招吧，愁死了！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-09 23:37:00
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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假陽性太多了，可能是載體自連了，所以菌液PCR 什么都沒有，很難挑到真陽性。你用什么酶切的，在做連接體系的時(shí)候，按1.6%加內(nèi)切酶在連接反應(yīng)體系里，連接反應(yīng)完成后，在37度中讓內(nèi)切酶反應(yīng)半小時(shí)，把自連的載體切開，這樣就減少了自連的假陽性。后面在做就能簡單點(diǎn)，我也和你一樣，現(xiàn)在假陽性是解決了菌液PCR 陽性也很正常，但提了質(zhì)粒又不對 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
3樓2013-12-09 22:52:47
weishengsu5
木蟲 (正式寫手)
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2樓2013-12-09 22:43:51
4樓2013-12-09 22:54:30
gyesang
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5樓2013-12-09 23:37:46
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