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愛(ài)吃小蘋(píng)果新蟲(chóng) (初入文壇)
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| 最近在做構(gòu)建,但是連接連了很久都沒(méi)連上,一端是平末端,一段是粘性末端,沒(méi)別的位點(diǎn)可以選了,只能用這個(gè)。用的Takara的T4連接酶,連接是按摩爾比加的,1:3,1:5,1:10都用過(guò),還加了PEG4000,4°、16°過(guò)夜都試過(guò),平板上會(huì)有很多菌落,但是菌落PCR一直都沒(méi)有條帶,應(yīng)該都試載體自連,片段3000bp,載體4900bp。哪位大神做過(guò)類(lèi)似的,麻煩支支招吧,愁死了! |
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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假陽(yáng)性太多了,可能是載體自連了,所以菌液PCR 什么都沒(méi)有,很難挑到真陽(yáng)性。你用什么酶切的,在做連接體系的時(shí)候,按1.6%加內(nèi)切酶在連接反應(yīng)體系里,連接反應(yīng)完成后,在37度中讓內(nèi)切酶反應(yīng)半小時(shí),把自連的載體切開(kāi),這樣就減少了自連的假陽(yáng)性。后面在做就能簡(jiǎn)單點(diǎn),我也和你一樣,現(xiàn)在假陽(yáng)性是解決了菌液PCR 陽(yáng)性也很正常,但提了質(zhì)粒又不對(duì) [ 發(fā)自小木蟲(chóng)客戶(hù)端 ] |
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新蟲(chóng) (初入文壇)
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