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滴答鐘鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助！共表達(dá)菌株搖瓶培養(yǎng)總是菌體裂解 已有2人參與
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求助各位師兄師姐，小弟最近做共表達(dá)，質(zhì)粒載體是pET-Duet1，表達(dá)宿主是E.coli BL21，載體上插了A和B兩個基因，為了考察表達(dá)效率構(gòu)建了A-B和B-A兩株菌，但是培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)A-B株菌培養(yǎng)和表達(dá)均正常，但是B-A株就是怎么養(yǎng)都會裂解，輕則澄清有絮狀雜質(zhì)，重則菌體碎片聚集成團。 附圖一張，這是裂解得很嚴(yán)重了 早前是種子液生長正常，轉(zhuǎn)接以后短時間生長正常，加入誘導(dǎo)劑后若干小時就會裂解，到后來連種子也會裂解了…… 之前也在網(wǎng)上看過相應(yīng)的問題貼，做過下列嘗試均無明顯改善： 1、劃線涂板，重新挑取單克隆，仍然裂解 2、提取質(zhì)粒重新做轉(zhuǎn)化，仍然裂解 3、分子實驗原代質(zhì)粒做轉(zhuǎn)化，仍然裂解 4、將裂解的培養(yǎng)液滴在長菌的AMP抗性平板上，37度培養(yǎng)過夜無噬菌斑形成 5、質(zhì)粒測序正確 6、更換抗生素和誘導(dǎo)劑，仍然裂解 小弟已經(jīng)卡在這里半個月了，求助大家，看看到底是啥原因~ 在此謝過 |
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reallpf
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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laozuzunzhe: 金幣+4, 鼓勵熱心應(yīng)助！ 2014-01-02 10:08:43
laozuzunzhe: 金幣+4, 鼓勵熱心應(yīng)助！ 2014-01-02 10:08:43
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可以發(fā)來你的重組質(zhì)粒元件圖譜看看，需要標(biāo)明基因，啟動子，終止子，抗性基因等基本信息，另外帶上重組構(gòu)建使用的酶切位點和位置。 感覺有染菌的可能性，但是你重新提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化仍然會裂解，重要的是A-B培養(yǎng)正常，似乎又減小了染菌的可能性。 個人建議：著重分析重組質(zhì)粒圖譜，分析兩者之間可能造成的差別；將A-B和B-A同時培養(yǎng)做對照，同時設(shè)置陰性對照；最后監(jiān)測下菌體裂解前后的培養(yǎng)基pH值變化情況，多做鏡檢，看看不同時期的菌體形態(tài)。 |
3樓2013-12-31 00:14:56
2樓2013-12-28 15:01:53
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