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liondolphin銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助�。�！大腸桿菌red重組出了問題
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| 我用red重組系統(tǒng)想將一個基因敲入到BL21（DE3）中去，先是將電轉(zhuǎn)后含有pKD46的菌在30度培養(yǎng)過夜，隔天接500ul到50ml三角瓶中等OD等于02時加入2ml 1M的ara誘導至OD=0.6，誘導了1h20min，之后冰上放置30min，4000g離心5min，再用10%甘油洗3遍，最后重懸于500ul10%甘油，100ul分裝。再在做好的感受態(tài)里加了10ul線性DNA，濃度300ng/ul，長度10kb，用的是全式金的fastpfu，是直接從質(zhì)粒上pcr下來的，沒有做膠回收，直接試劑盒純化。混勻冰上放30min后電轉(zhuǎn)，0.4cm電擊杯，2500V，5ms，馬上加入1mlLB，37度搖1.5h后全部涂板，結(jié)果今天長成片了。我導入的線性DNA含有潮霉素抗性基因，lacZ和sacB，在200ug/ml hyg，80ug/ml x-gal的平板上全是藍色的根本沒法挑單菌落。BL21(DE3)的敲除效率不是極低嗎，怎么會這樣？是不是因為我沒做膠回收，pcr片段里有質(zhì)粒才這樣的，但是上次轉(zhuǎn)pKD46進去的時候也是全涂但是就長了2個菌落出來 |
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domopal
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 微生物遺傳學
2樓2017-07-26 08:57:58
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