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liondolphin銀蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助�。�！大腸桿菌red重組出了問(wèn)題
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| 我用red重組系統(tǒng)想將一個(gè)基因敲入到BL21（DE3）中去，先是將電轉(zhuǎn)后含有pKD46的菌在30度培養(yǎng)過(guò)夜，隔天接500ul到50ml三角瓶中等OD等于02時(shí)加入2ml 1M的ara誘導(dǎo)至OD=0.6，誘導(dǎo)了1h20min，之后冰上放置30min，4000g離心5min，再用10%甘油洗3遍，最后重懸于500ul10%甘油，100ul分裝。再在做好的感受態(tài)里加了10ul線性DNA，濃度300ng/ul，長(zhǎng)度10kb，用的是全式金的fastpfu，是直接從質(zhì)粒上pcr下來(lái)的，沒(méi)有做膠回收，直接試劑盒純化�；靹虮戏�30min后電轉(zhuǎn)，0.4cm電擊杯，2500V，5ms，馬上加入1mlLB，37度搖1.5h后全部涂板，結(jié)果今天長(zhǎng)成片了。我導(dǎo)入的線性DNA含有潮霉素抗性基因，lacZ和sacB，在200ug/ml hyg，80ug/ml x-gal的平板上全是藍(lán)色的根本沒(méi)法挑單菌落。BL21(DE3)的敲除效率不是極低嗎，怎么會(huì)這樣？是不是因?yàn)槲覜](méi)做膠回收，pcr片段里有質(zhì)粒才這樣的，但是上次轉(zhuǎn)pKD46進(jìn)去的時(shí)候也是全涂但是就長(zhǎng)了2個(gè)菌落出來(lái) |
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domopal
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
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- 專業(yè): 微生物遺傳學(xué)
2樓2017-07-26 08:57:58
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