 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4248 | 回復(fù): 49 | |||
山水88木蟲 (正式寫手)
|
[求助]
Red重組老是不成功，求救
|
||
| 用Red重組敲除基因，做了一個多月了，還是沒有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后來換了酶解決了，轉(zhuǎn)了pKD46之后的菌株誘導(dǎo)表達(dá)到OD0.6制備感受態(tài)轉(zhuǎn)化PCR片段，過程應(yīng)該都是比較常規(guī)的了，可是這么久就是不成功，請問有做過的指點(diǎn)一下，謝謝了，浪費(fèi)不起時間了 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 生物科學(xué) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有183人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- pET-22b構(gòu)建好了質(zhì)粒，表達(dá)不出來？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 大腸桿菌Red重組法基因敲除求助
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 基因敲除不成功
已經(jīng)有10人回復(fù)
- Red重組中pKD3,pKD4,pKD46的抗性疑問
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求助：重組質(zhì)粒酶切問題！請大家?guī)臀医鉀Q一下，急！
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于重組質(zhì)粒的構(gòu)建，總是失敗，希望高手指點(diǎn)一下啊～～
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【求助/交流】細(xì)菌同源重組的同源臂最少需要多少bp呢？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】重組菌表達(dá)蛋白量如何測定？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】重組蛋白融合標(biāo)簽的選擇
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】對于BL21，含有那種形態(tài)的重組質(zhì)粒多則誘導(dǎo)表達(dá)量高呢？超螺旋？線性？?/a>
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】帶GST標(biāo)簽的重組蛋白的純化？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 【求助/交流】重組質(zhì)粒PCR的taq酶選擇！
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】請教關(guān)于大腸桿菌lamda RED重組問題
已經(jīng)有23人回復(fù)
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
山水88: 金幣+20 2013-11-03 17:43:17
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。從根本去入手 2013-11-04 08:35:42
山水88: 金幣+15, 終于成功了，謝謝您的幫助！ 2013-12-09 21:50:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
山水88: 金幣+20 2013-11-03 17:43:17
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。從根本去入手 2013-11-04 08:35:42
山水88: 金幣+15, 終于成功了，謝謝您的幫助！ 2013-12-09 21:50:22
|
反正我最開始用tet做過 后來覺得問題太多（你假的菌落是不是比正常的��？ BW25113長的很快的，菌落比dh5alpha也大很多） 直接換其他抗性了，Kan clora spec都不會長假的，就是clora可能選擇壓力略大，不過長出來的都是一定有抗性的，另外重組質(zhì)粒用psim19效率比pkd46高差不多一個數(shù)量級（pBad其實(shí)是個比較爛的誘導(dǎo)promoter）。 Ara0.2%差不多是10mM還多了，06年有文章說這個略微有點(diǎn)高（其實(shí)高濃度的Ara對E coli有點(diǎn)毒性），不過這個和誘導(dǎo)時間有關(guān)，我是OD=0.1誘導(dǎo)后1hr的。 |
7樓2013-11-02 02:13:19
oaixlittle
金蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 689.6
- 帖子: 47
- 在線: 45.8小時
- 蟲號: 1094663
- 注冊: 2010-09-10
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
山水88: 金幣+5 2013-11-03 17:43:41
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待更詳細(xì)的解答 2013-11-04 08:35:56
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
山水88: 金幣+5 2013-11-03 17:43:41
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待更詳細(xì)的解答 2013-11-04 08:35:56
|
以前我們做這個轉(zhuǎn)化效率不高，就是增加感受態(tài)和PCR片段的量，50ml菌體做一管感受態(tài)，PCR產(chǎn)物50或100ul沉淀到5ul直接全部轉(zhuǎn)掉 假陽性多可能是你PCR的模板沒弄好，一定不能有質(zhì)�；煸诶锩�。我們用的是pIJ773，一定要確保完全酶切，片段電泳后膠回收，處理成線性片段再去做模板 |
13樓2013-11-02 15:25:13
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
16樓2013-11-02 22:53:02
guohuayin
木蟲 (著名寫手)
博士，副教授
- 應(yīng)助: 23 (小學(xué)生)
- 金幣: 3338.8
- 散金: 265
- 紅花: 17
- 帖子: 1521
- 在線: 101.7小時
- 蟲號: 219355
- 注冊: 2006-03-13
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
山水88: 金幣+10 2013-11-03 17:44:04
山水88: 金幣+10 2013-11-03 17:44:04
|
這是我能想到的解決辦法：我看你做的實(shí)驗(yàn)，不應(yīng)該是抗生素失效的問題，不過四環(huán)素抗性確實(shí)不好用，你可以給朱老師索要其他抗性質(zhì)粒做個對照試試，也許就做出來了。同時我建議你檢查所用的所有的實(shí)驗(yàn)材料，重組質(zhì)粒，包括菌株是否正確，我做重組時，都是一個一個材料核實(shí)，確保重組系統(tǒng)沒有問題，有些問題是當(dāng)時我自己都沒有料想到的，覺得不應(yīng)該出現(xiàn)的問題，但是就是出錯了，（比如曾經(jīng)碰到重組質(zhì)粒出錯，抗生素失效，而這些都是問題的關(guān)鍵）�？傊�，重組碰到的問題太多，細(xì)心才能解決所有的問題。 |
18樓2013-11-03 01:02:17
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
27樓2013-11-19 10:12:10
山水88
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 2526.7
- 散金: 190
- 紅花: 2
- 帖子: 389
- 在線: 280.6小時
- 蟲號: 1071557
- 注冊: 2010-08-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
31樓2013-11-19 15:36:22
guohuayin
木蟲 (著名寫手)
博士，副教授
- 應(yīng)助: 23 (小學(xué)生)
- 金幣: 3338.8
- 散金: 265
- 紅花: 17
- 帖子: 1521
- 在線: 101.7小時
- 蟲號: 219355
- 注冊: 2006-03-13
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
|
http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做過Red重組敲除大腸桿菌基因，上面是我發(fā)的帖子，混總了一下相關(guān)問題，你可以參考一下，如果有問題，歡迎交流。 |
2樓2013-11-01 20:29:45
山水88
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 2526.7
- 散金: 190
- 紅花: 2
- 帖子: 389
- 在線: 280.6小時
- 蟲號: 1071557
- 注冊: 2010-08-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
3樓2013-11-01 21:09:04
山水88
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 2526.7
- 散金: 190
- 紅花: 2
- 帖子: 389
- 在線: 280.6小時
- 蟲號: 1071557
- 注冊: 2010-08-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
4樓2013-11-01 21:17:33
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
5樓2013-11-01 22:45:42
山水88
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 2526.7
- 散金: 190
- 紅花: 2
- 帖子: 389
- 在線: 280.6小時
- 蟲號: 1071557
- 注冊: 2010-08-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
|
1、將PKD46化轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，初步驗(yàn)證后，接種至AMP培養(yǎng)基中30度過夜培養(yǎng)，次日1：50轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.2時加入阿拉伯糖至終濃度0.2%,繼續(xù)培養(yǎng)到OD0.6時，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，10%甘油洗滌。 2、將打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V電轉(zhuǎn)至感受態(tài)中，30度培養(yǎng)2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。 你說的Tet避光才開始我不知道，但是同時做了DH5a的對照沒有長出菌落，因此抗性是存在的或者說操作對其影響不是很大。然后PCR完后沒有經(jīng)過DpnI處理而是跑膠回收的，在長出的菌落里提質(zhì)粒沒有發(fā)現(xiàn)模板質(zhì)粒的存在，因此這步也應(yīng)該不是問題吧。導(dǎo)入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面換了酶回收以后取0.5ul就能夠達(dá)到和Marker差不多的量度了，而且這樣我還是大量回收然后共沉之后電轉(zhuǎn)的。我能想到的就是這些了，謝謝！ |
6樓2013-11-02 00:05:54
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
8樓2013-11-02 04:03:48
山水88
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 2526.7
- 散金: 190
- 紅花: 2
- 帖子: 389
- 在線: 280.6小時
- 蟲號: 1071557
- 注冊: 2010-08-09
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
9樓2013-11-02 11:52:55
Haibara_Ai
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 57 (初中生)
- 金幣: 1896.7
- 紅花: 3
- 帖子: 262
- 在線: 306.9小時
- 蟲號: 2222431
- 注冊: 2013-01-05
10樓2013-11-02 14:28:36
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 山水88 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 323求調(diào)劑 +6 | 洼小桶 2026-03-18 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 08工科 320總分 求調(diào)劑 +11 | 梨花珞晚風(fēng) 2026-03-17 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南化學(xué)（0703）總分337求調(diào)劑 +9 | niko- 2026-03-19 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +6 | shansx 2026-03-22 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 廣西大學(xué)材料導(dǎo)師推薦 +3 | 夏夏夏小正 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | @taotao 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +3 | 喜歡還是不甘心 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +11 | 戲精丹丹丹 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料 271求調(diào)劑 +5 | 展信悅_ 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +4 | www_q 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 346求調(diào)劑[0856] +4 | WayneLim327 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿山大07化學(xué) 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調(diào)劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +4 | ydfyh 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 22408 344分 求調(diào)劑 一志愿 華電計算機(jī)技術(shù) +4 | solanXXX 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +10 | 慕寒mio 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿福大288有機(jī)化學(xué)，求調(diào)劑 +3 | 小木蟲200408204 2026-03-18 | 3/150 |
|