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山水88木蟲 (正式寫手)
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[求助]
Red重組老是不成功，求救
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| 用Red重組敲除基因，做了一個(gè)多月了，還是沒有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后來換了酶解決了，轉(zhuǎn)了pKD46之后的菌株誘導(dǎo)表達(dá)到OD0.6制備感受態(tài)轉(zhuǎn)化PCR片段，過程應(yīng)該都是比較常規(guī)的了，可是這么久就是不成功，請(qǐng)問有做過的指點(diǎn)一下，謝謝了，浪費(fèi)不起時(shí)間了 |
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反正我最開始用tet做過 后來覺得問題太多（你假的菌落是不是比正常的�。� BW25113長(zhǎng)的很快的，菌落比dh5alpha也大很多） 直接換其他抗性了，Kan clora spec都不會(huì)長(zhǎng)假的，就是clora可能選擇壓力略大，不過長(zhǎng)出來的都是一定有抗性的，另外重組質(zhì)粒用psim19效率比pkd46高差不多一個(gè)數(shù)量級(jí)（pBad其實(shí)是個(gè)比較爛的誘導(dǎo)promoter）。 Ara0.2%差不多是10mM還多了，06年有文章說這個(gè)略微有點(diǎn)高（其實(shí)高濃度的Ara對(duì)E coli有點(diǎn)毒性），不過這個(gè)和誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)，我是OD=0.1誘導(dǎo)后1hr的。 |
7樓2013-11-02 02:13:19
oaixlittle
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以前我們做這個(gè)轉(zhuǎn)化效率不高，就是增加感受態(tài)和PCR片段的量，50ml菌體做一管感受態(tài)，PCR產(chǎn)物50或100ul沉淀到5ul直接全部轉(zhuǎn)掉 假陽性多可能是你PCR的模板沒弄好，一定不能有質(zhì)�；煸诶锩妗Ｎ覀冇玫氖莗IJ773，一定要確保完全酶切，片段電泳后膠回收，處理成線性片段再去做模板 |
13樓2013-11-02 15:25:13
Haibara_Ai
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山水88: 金幣+10 2013-11-03 17:44:04
山水88: 金幣+10 2013-11-03 17:44:04
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這是我能想到的解決辦法：我看你做的實(shí)驗(yàn)，不應(yīng)該是抗生素失效的問題，不過四環(huán)素抗性確實(shí)不好用，你可以給朱老師索要其他抗性質(zhì)粒做個(gè)對(duì)照試試，也許就做出來了。同時(shí)我建議你檢查所用的所有的實(shí)驗(yàn)材料，重組質(zhì)粒，包括菌株是否正確，我做重組時(shí)，都是一個(gè)一個(gè)材料核實(shí)，確保重組系統(tǒng)沒有問題，有些問題是當(dāng)時(shí)我自己都沒有料想到的，覺得不應(yīng)該出現(xiàn)的問題，但是就是出錯(cuò)了，（比如曾經(jīng)碰到重組質(zhì)粒出錯(cuò)，抗生素失效，而這些都是問題的關(guān)鍵）�？傊亟M碰到的問題太多，細(xì)心才能解決所有的問題。 |
18樓2013-11-03 01:02:17
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你重組質(zhì)粒是哪個(gè)（哪篇文獻(xiàn)）？重組酶的啟動(dòng)子是什么？ red系統(tǒng)是對(duì)細(xì)胞有毒的，你至少應(yīng)該等OD到0.1再開始誘導(dǎo)（如果是PL系的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)20min左右就可以了），另外2mMIPTG已經(jīng)對(duì)細(xì)胞有些毒性了，SOB我沒用過，但是葡萄糖對(duì)整個(gè)細(xì)胞代謝（蛋白質(zhì)合成）是有影響的，另外OD=0.6有點(diǎn)偏高，0.4左右比較好 另外最后一步我沒試過30°帶原始質(zhì)粒過夜，不過我覺得這樣總是給細(xì)胞增加壓力。 |
27樓2013-11-19 10:12:10
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31樓2013-11-19 15:36:22
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http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做過Red重組敲除大腸桿菌基因，上面是我發(fā)的帖子，混總了一下相關(guān)問題，你可以參考一下，如果有問題，歡迎交流。 |
2樓2013-11-01 20:29:45
山水88
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還有一個(gè)就是，我想敲除的是三個(gè)串聯(lián)基因，大小在2.5kb，應(yīng)該說也不是很大了，不知道這個(gè)會(huì)有影響么。另外一個(gè)就是我使用的是四環(huán)素抗性基因片段，以前這個(gè)抗生素也沒用過，所以對(duì)它的使用注意事項(xiàng)也不是很清楚，如果是抗性失效的話，長(zhǎng)出假陽性也就可以理解了，但同時(shí)我做DH5a對(duì)照是沒有菌落長(zhǎng)出來的，因此重組效率不高應(yīng)該是主要問題了，當(dāng)然，四環(huán)素使用注意事項(xiàng)也煩請(qǐng)老師指點(diǎn)一二，謝謝！ |
4樓2013-11-01 21:17:33
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1、將PKD46化轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，初步驗(yàn)證后，接種至AMP培養(yǎng)基中30度過夜培養(yǎng)，次日1：50轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.2時(shí)加入阿拉伯糖至終濃度0.2%,繼續(xù)培養(yǎng)到OD0.6時(shí)，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，10%甘油洗滌。 2、將打靶分子（Tet抗性）>100ng左右（同源臂50bp），2500V電轉(zhuǎn)至感受態(tài)中，30度培養(yǎng)2h后，涂布于Tet抗性的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。 你說的Tet避光才開始我不知道，但是同時(shí)做了DH5a的對(duì)照沒有長(zhǎng)出菌落，因此抗性是存在的或者說操作對(duì)其影響不是很大。然后PCR完后沒有經(jīng)過DpnI處理而是跑膠回收的，在長(zhǎng)出的菌落里提質(zhì)粒沒有發(fā)現(xiàn)模板質(zhì)粒的存在，因此這步也應(yīng)該不是問題吧。導(dǎo)入的抗性基因片段之前是PCR量太少，后面換了酶回收以后取0.5ul就能夠達(dá)到和Marker差不多的量度了，而且這樣我還是大量回收然后共沉之后電轉(zhuǎn)的。我能想到的就是這些了，謝謝！ |
6樓2013-11-02 00:05:54
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8樓2013-11-02 04:03:48
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9樓2013-11-02 11:52:55
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10樓2013-11-02 14:28:36
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