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海之韻-哈哈銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
native-page活性染色 已有3人參與
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| 最近在做native-page活性染色，蛋白為木聚糖酶，理論上染色脫色后目的條帶處應(yīng)為無色且為單一條帶，膠的其余部分應(yīng)為紅色。但是我做出來的結(jié)果是從點(diǎn)樣孔到膠的三分之一處是無色的，而不是一條單一的條帶，感覺目的蛋白是邊跑邊反應(yīng)。（跑膠時(shí)是在冰浴中進(jìn)行的）請問有沒有這種邊跑邊反應(yīng)的可能性��？如何避免這種情況？ |
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5樓2014-01-05 18:40:56
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7樓2014-01-06 21:00:14
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Native-page:12%分離膠配方(10ml):水 2.4ml，30%丙烯酰胺 4ml，1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml，10% APS 0.1ml，TEMED 0.004ml，1%木聚糖溶液（pH8.0 Tris-HCl配制）1ml 5%濃縮膠配方（5ml）：水 3.45ml，30%丙烯酰胺 0.83ml，1M pH6.8 Tris-HCl 0.63ml，10% APS 0.05ml，TEMED 0.005ml 5*Native-page上樣buffer：1M pH6.8 Tris-HCl 1.25ml，溴酚藍(lán)10mg，甘油2.5ml 剛果紅染液：0.5g剛果紅溶解到100ml 10%的乙醇中。 上樣后80V50mA電泳至溴酚藍(lán)前沿距膠1cm處，停止電泳。取出膠，浸泡在pH6.5檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（緩沖液是酶的最適反應(yīng)緩沖液）中55度水浴30分鐘，取出自來水沖洗兩遍，加入剛果紅染液染色30分鐘，用1MNaCl溶液洗脫直至有清晰的條帶出現(xiàn)。 電泳結(jié)果：1為原酶液，2酶液稀釋10倍，3酶液稀釋20倍，4酶液稀釋50倍,5酶液稀釋100倍 原酶液是由0.9%NaCl懸浮菌體超聲波破碎后的上清液。 這次結(jié)果原酶液中跑出來一條帶，但是跑不下來，溴酚藍(lán)前沿已經(jīng)跑到膠的最下面了。而且脫色后膠變成了黑色，以前用同樣的方法染色脫色后膠布變黑，是紅色的。 111.jpg |
9樓2014-01-07 12:11:05
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10樓2014-01-07 18:41:52
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