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a070274011新蟲 (初入文壇)
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凝膠遷移實驗（EMSA）常見問題 已有2人參與
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1. 什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？ 凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。 2. 實驗中需要用到什么試劑？ 凝膠遷移實驗需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(tǒng)（a,b）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA 5'末端標(biāo)記系統(tǒng)，用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。 3. 凝膠遷移實驗系統(tǒng)提供了什么試劑？ Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實驗的一種陽性對照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液，和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。 4. 成功進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化哪些因素？ 凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點特點的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應(yīng)總體積應(yīng)最小（20μl）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5）， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9）， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實驗的起始。試劑耗材可以到中國實驗室耗材網(wǎng)biolabware.cn購買 5. 在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？ 目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp），這樣結(jié)合位點可和其他因子的結(jié)合位點區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。 6. 用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。 當(dāng)用HeLa細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。 [ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:31 ] |
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3樓2017-12-25 16:33:41
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