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1296785943鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET28a重組質(zhì)粒酶切后有三條？ 已有3人參與
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酶切體系： 質(zhì)粒 6 μl 10*Buufer 1 μl bamH1 0.5 μl sal1 0.5 μl ddH2O 2 μl 37℃酶切1.5h 酶切結(jié)果如圖片 條帶順序： 右邊開始依次為：marker 酶切前、酶切后，依次類推共28 個樣。此后兩個樣為空載酶切前，空載酶切后。 問題：1、為什么酶切后大多數(shù)成3條帶（目的片段中沒有上述酶切位點(diǎn)）？ 2、酶切前的質(zhì)粒條帶為什么比酶切后的條帶還要��？ 請各位高手指點(diǎn)迷津，謝謝�。�！ ２０１４０0306meiqiejianding.jpg |
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youlinglyw
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其實(shí)都是一些瑣碎問題。 鑒定體系跟你差不多吧，最多翻個倍，時間我一般切6小時以上 制膠的時候，膠溶解好后，自然冷卻到6、7十度，然后倒膠，膠濃度選擇好，這個網(wǎng)上有參考 電泳時候，初始先用100v左右跑個幾分鐘，讓條帶充分?jǐn)D壓后進(jìn)入膠內(nèi)。然后再用110或120v跑，電泳槽發(fā)熱不要太明顯 還有，你的酶切效率似乎不高，或者說，你的酶存在多個酶切位點(diǎn)。 buffer的選擇也是有講究的。另外，兩個酶不一定是1:1 你最好看看你的酶在這個buffer里效率如何 我記得有個t-buffer，是個很神奇的buffer |
7樓2014-03-09 10:50:47
youlinglyw
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你的問題 1載體酶切后一般是兩部分，一大一小，如果總是三部分，不排除你的質(zhì)粒上發(fā)生了突變，產(chǎn)生新的位點(diǎn) 2質(zhì)粒環(huán)狀跑得快，線性載體跑得慢。切開后，往往會出現(xiàn)質(zhì)粒大小在中間，載體在上面，目的片段在下面的情況 額外說點(diǎn) 1 我覺得你的體系小了點(diǎn)。 我作載體酶切，一般都是十幾二十的質(zhì)粒，然后酶量也少了些，多加點(diǎn) 畢竟酶切后，電泳上樣要多點(diǎn) 2 貌似你的電泳效果不好 可能問題是制膠問題，以及電泳液不干凈 3 我經(jīng)常過夜酶切 |
2樓2014-03-07 10:42:41
【答案】應(yīng)助回帖
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第一個問題：一種是你雙酶切體系問題，酶切不完全，存在未被雙切的質(zhì)粒，所以有3條帶；還有一種可能就是質(zhì)粒上堿基發(fā)生了突變，產(chǎn)生一個BamHl或者Sall的酶切位點(diǎn)（這個可能性很�。�。 第二個問題：質(zhì)粒被切成線性，比未切之前（超螺旋）跑的慢是沒有問題的。質(zhì)粒有三種構(gòu)型。第一種是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型。第二種是開環(huán)DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口。第三種是線狀DNA，這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂呈線狀。這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線性構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。 PS:樓主的雙酶切體系模板量太大，10ul總體系太小，建議重新更換體系試試。 |
3樓2014-03-07 12:43:57
鬼羽帝魂
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你的膠跑的不清楚，沒有拍攝清楚，沒有調(diào)節(jié)清楚模糊的那個按鍵吧？ 跑膠時間太短了，marker 都還沒分開。 1.酶切后大多數(shù)成3條帶，說明你的載體上 bamH1、sal1其中的一個酶有2個酶切位點(diǎn)。 或者，你沒有酶切完全，這樣就有3條帶：質(zhì)粒（單酶切的）、載體、目的片段。 質(zhì)粒 6 μl大約是多少ng？bamH1 0.5 μl+ sal10.5 μl切的是<=500ng的質(zhì)粒。. 2.同2.3樓。 |
4樓2014-03-07 15:02:31
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