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1296785943鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET28a重組質粒酶切后有三條？ 已有3人參與
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酶切體系： 質粒 6 μl 10*Buufer 1 μl bamH1 0.5 μl sal1 0.5 μl ddH2O 2 μl 37℃酶切1.5h 酶切結果如圖片 條帶順序： 右邊開始依次為：marker 酶切前、酶切后，依次類推共28 個樣。此后兩個樣為空載酶切前，空載酶切后。 問題：1、為什么酶切后大多數(shù)成3條帶（目的片段中沒有上述酶切位點）？ 2、酶切前的質粒條帶為什么比酶切后的條帶還要�。� 請各位高手指點迷津，謝謝�。�！ ２０１４０0306meiqiejianding.jpg |
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9樓2014-03-09 23:33:08
youlinglyw
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-03-07 12:02:01
1296785943: 金幣+5, ★有幫助 2014-03-09 10:01:50
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1296785943: 金幣+5, ★有幫助 2014-03-09 10:01:50
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你的問題 1載體酶切后一般是兩部分，一大一小，如果總是三部分，不排除你的質粒上發(fā)生了突變，產生新的位點 2質粒環(huán)狀跑得快，線性載體跑得慢。切開后，往往會出現(xiàn)質粒大小在中間，載體在上面，目的片段在下面的情況 額外說點 1 我覺得你的體系小了點。 我作載體酶切，一般都是十幾二十的質粒，然后酶量也少了些，多加點 畢竟酶切后，電泳上樣要多點 2 貌似你的電泳效果不好 可能問題是制膠問題，以及電泳液不干凈 3 我經常過夜酶切 |
2樓2014-03-07 10:42:41
【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2014-03-31 15:31:51
感謝參與，應助指數(shù) +1
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第一個問題：一種是你雙酶切體系問題，酶切不完全，存在未被雙切的質粒，所以有3條帶；還有一種可能就是質粒上堿基發(fā)生了突變，產生一個BamHl或者Sall的酶切位點（這個可能性很小）。 第二個問題：質粒被切成線性，比未切之前（超螺旋）跑的慢是沒有問題的。質粒有三種構型。第一種是共價閉合環(huán)狀DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結構，通常呈超螺旋構型。第二種是開環(huán)DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結構，另一條單鏈上有一到幾個切口。第三種是線狀DNA，這種質粒的雙鏈斷裂呈線狀。這三種構型的同一種質粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構型，其次是線性構型，最慢的是開環(huán)構型。 PS:樓主的雙酶切體系模板量太大，10ul總體系太小，建議重新更換體系試試。 |
3樓2014-03-07 12:43:57
鬼羽帝魂
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4樓2014-03-07 15:02:31
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