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lixg鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于載體改造 已有2人參與
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我要進(jìn)行載體改造，將載體A中的一個(gè)片段切下來(lái)，裝到載體B中。由于酶切位點(diǎn)不很合適，只能做如下平末端連接。擬定下列操作，請(qǐng)高手看看合適不？如不合適，如何改進(jìn)？ 1. 將載體A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端補(bǔ)平，電泳，切膠，回收純化約目的片段。 2. 將載體B用BamHI酶切（位于多克隆位點(diǎn)內(nèi)），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，過柱子純化、去磷酸化。 3. 將上述1.2所得產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化。 主要請(qǐng)高手們參謀參謀第一步和第二步是否合適。 |
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Lau_Kimura
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金幣+5, ★★★很有幫助, 嗯，按照我的方案如果做不出來(lái)，就用你的方案做一下。畢竟平端不好連。非常感謝！ 2014-03-09 09:55:09
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通過PCR克隆，把載體A的那個(gè)片段切下來(lái)。這個(gè)方案不行？ 1、設(shè)計(jì)引物，5‘端添加所需的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 2、PCR擴(kuò)增（載體A為模版），產(chǎn)物純化、酶切回收目的片段。 3、載體B酶切回收目的片段。 4、上述2、3的目的片段連接，轉(zhuǎn)化，搖菌。 5、菌落PCR和酶切驗(yàn)證大小后，送測(cè)序，看是否有載體A是否有PCR導(dǎo)致的堿基突變。 注：9kb全基因的互補(bǔ)載體，我們也是引物新增酶切位點(diǎn)分為一段段地構(gòu)建好，再連接在一起的。 |
lixg2樓2014-03-08 20:40:43
lvbobo823
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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4樓2014-03-09 09:58:36
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可以試試這篇論文的方法，雖然是個(gè)小的改進(jìn)，但是值得一試，而且很方便： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256 |
5樓2014-03-25 18:10:02
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可以試試這篇論文的方法，雖然是個(gè)小的改進(jìn)，但是值得一試，而且很方便： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256 |
6樓2014-03-25 19:13:16
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7樓2014-03-27 18:25:05
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