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sky_x1227鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
液相色譜反向C18柱分離多肽 流動(dòng)相的選擇問(wèn)題 已有1人參與
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大家好，我用液相色譜分離多肽，選用的是反向C18的柱子，我的蛋白是水溶性的蛋白，反向C18因其調(diào)料為非極性的鍵合相不能承受純水做流動(dòng)相，咨詢(xún)下大家最常用的是選用什么樣的有機(jī)溶劑，又不對(duì)蛋白樣品有什么損傷，希望有經(jīng)驗(yàn)的童鞋給些建議。越詳細(xì)越好噢~ |
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zhu007liang
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2樓2014-07-15 15:57:32
【答案】應(yīng)助回帖
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首先應(yīng)該能與樣品溶液有很好的相溶性，且洗脫能力要比樣品的稀釋液的洗脫能力強(qiáng)，一般最好流動(dòng)相與稀釋液一樣。 再者流動(dòng)相與稀釋液不應(yīng)再樣品的紫外吸收波長(zhǎng)處有吸收，一般有機(jī)溶劑首選乙腈，因?yàn)樵?.0ml/min條件下，乙腈與水溶液混溶時(shí)壓力變化不是很大，不會(huì)影響柱子的使用壽命。再者，乙腈的紫外吸收截止波長(zhǎng)較短（在210nm左右）。 再者就是有機(jī)溶劑的黏度了，黏度太大會(huì)增大柱壓，就黏度而言，乙腈、甲醇是首選。 流動(dòng)相一般為緩沖鹽與有機(jī)相的混合液。有機(jī)溶劑中能與緩沖鹽有很好的相溶性的就數(shù)乙腈和甲醇了。 根據(jù)你的分析物質(zhì)的不同，流動(dòng)相的極性的要求也不同，這時(shí)需要通過(guò)不斷地調(diào)節(jié)有機(jī)相的比例來(lái)獲得很好的分離度、出峰時(shí)間、峰形的對(duì)稱(chēng)性、等等。 如果你分析的物質(zhì)是中性的分子或非解離型物質(zhì)，這時(shí)的流動(dòng)相用流動(dòng)相與超純水的混合液即可。如果樣品溶液中有離子的其他物質(zhì)的干擾，此時(shí)就需要調(diào)節(jié)流動(dòng)相中緩沖鹽的pH了。 怎么確定你分析的物質(zhì)中存在離子或其他干擾物質(zhì)的存在呢？ 用如下辦法可以確定有無(wú)離子或干擾物質(zhì)的存在影響分析——在同樣的色譜條件下每批樣品的分析結(jié)果不能很好的重現(xiàn)，或者說(shuō)分離效果不明顯。 如果是解離性的物質(zhì)，則流動(dòng)相為有機(jī)相與緩沖鹽的混合液，且流動(dòng)相中的緩沖鹽則必須調(diào)節(jié)pH,不然分析效果肯定不理想。一般pH與樣品主成分的pKa之差大于2，才能獲得較好的分離效果。 現(xiàn)在一般的C18色譜柱，能耐受的pH范圍是2-8，也有范圍更寬的，可以參照色譜柱說(shuō)明書(shū)。所以流動(dòng)相中添加磷酸、甲酸、乙酸什么的都沒(méi)有任何問(wèn)題，只要pH在耐受范圍即可。但是，選擇流動(dòng)相添加劑也是有講究的，比如你方法選用的波長(zhǎng)是210nm，那么最好不要用甲酸乙酸，因?yàn)榧姿嵋宜岬慕刂共ㄩL(zhǎng)大于210nm，會(huì)造成基線(xiàn)漂移嚴(yán)重；另外，如果你流動(dòng)相的pH是4.0，那么不建議使用磷酸鹽，因?yàn)榱姿猁}/磷酸在pH4.0附近是沒(méi)有緩沖能力的，流動(dòng)相的pH很容易發(fā)生變化，導(dǎo)致出峰重現(xiàn)性差。 |
3樓2014-07-17 22:50:54
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