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mf書蟲銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
急求PCR相關(guān)知識(shí)
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求助PCR注意要點(diǎn)，尤其是退火溫度和時(shí)間對(duì)PCR的影響，延伸時(shí)間和片段長(zhǎng)短的關(guān)系。 我做的全基因檢測(cè)，有一個(gè)基因別人退火時(shí)間30s就能跑出來(lái)，我的要1分30s才能有，大約一千bp，我想知道退貨時(shí)間這么長(zhǎng)會(huì)不會(huì)有什么影響 |
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mf書蟲
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3樓2014-04-10 14:40:16
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【答案】應(yīng)助回帖
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其實(shí)PCR的退火溫度和時(shí)間是根據(jù)你的引物和目的片段大小而定的。 時(shí)間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在 AT(退火溫度）.時(shí)也會(huì)有一些活性. 所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。 退火溫度和片段長(zhǎng)度相關(guān)，片段長(zhǎng)退火時(shí)間長(zhǎng)一些，一般2min也可以的 預(yù)變性和變性的時(shí)間是由模板的長(zhǎng)度和GC含量來(lái)確定的，當(dāng)然這個(gè)時(shí)間并不像退火溫度那樣有個(gè)可以參考的計(jì)算公式，一般來(lái)講預(yù)變性95℃，5min完全可以解開模板的雙鏈，如果模板分子量比較大（比如是從基因組DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，那時(shí)間延伸到10min也是可以的），變性時(shí)間通常也是30S足夠了，也可以根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（是擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而不是原始模板長(zhǎng)度）和GC含量進(jìn)行微調(diào)。 退火是為了讓引物與模板結(jié)合，一般來(lái)講30s足夠了，如果退火時(shí)間延長(zhǎng)那么引物在酶的作用下就會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此在擴(kuò)增比較短的片段時(shí)通常會(huì)把退火和延伸步驟合并（即所謂的兩步法擴(kuò)增） |
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mf書蟲4樓2014-04-10 18:04:58
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