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mf書蟲銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
急求PCR相關(guān)知識
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求助PCR注意要點(diǎn)，尤其是退火溫度和時間對PCR的影響，延伸時間和片段長短的關(guān)系。 我做的全基因檢測，有一個基因別人退火時間30s就能跑出來，我的要1分30s才能有，大約一千bp，我想知道退貨時間這么長會不會有什么影響 |
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mf書蟲
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5樓2014-04-15 08:33:27
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2樓2014-04-09 23:56:58
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3樓2014-04-10 14:40:16
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【答案】應(yīng)助回帖
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其實(shí)PCR的退火溫度和時間是根據(jù)你的引物和目的片段大小而定的。 時間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在 AT(退火溫度）.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。 退火溫度和片段長度相關(guān)，片段長退火時間長一些，一般2min也可以的 預(yù)變性和變性的時間是由模板的長度和GC含量來確定的，當(dāng)然這個時間并不像退火溫度那樣有個可以參考的計(jì)算公式，一般來講預(yù)變性95℃，5min完全可以解開模板的雙鏈，如果模板分子量比較大（比如是從基因組DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，那時間延伸到10min也是可以的），變性時間通常也是30S足夠了，也可以根據(jù)擴(kuò)增片段長度（是擴(kuò)增片段長度而不是原始模板長度）和GC含量進(jìn)行微調(diào)。 退火是為了讓引物與模板結(jié)合，一般來講30s足夠了，如果退火時間延長那么引物在酶的作用下就會進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此在擴(kuò)增比較短的片段時通常會把退火和延伸步驟合并（即所謂的兩步法擴(kuò)增） |
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4樓2014-04-10 18:04:58
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