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檸檬可樂星新蟲 (小有名氣)
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PCR產(chǎn)物做克隆，菌液涂平板后長得很慢是什么原因？ 已有5人參與
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各位大蝦：我現(xiàn)在要把PCR產(chǎn)物做克隆，菌復(fù)壯后（37℃搖菌1h），4000rpm離心數(shù)秒，留下約300ul的菌液，吹打均勻，取20-30ul涂平板，37℃培養(yǎng)17h左右菌落還是比較小，而且菌落數(shù)量并不多，請問可能會(huì)是什么原因��？ ps：我之前做克隆，到這一步，情況是菌落密密麻麻還很小，這次減少了涂平板的菌液量，菌落是少了，但還是長得那么慢。 |
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這個(gè)應(yīng)該跟感受態(tài)有關(guān)系。DH5a的感受態(tài)37度12小時(shí)左右就挺大的了，10小時(shí)就可以挑。 我一般做DH5a是菌復(fù)壯后（37℃搖菌40-50min），6000rpm離心數(shù)秒，留下約100ul的菌液，吹打均勻涂平板，37℃培養(yǎng)至長得比較大。一般為12小時(shí)。 |
2樓2014-04-14 17:10:26
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我一直用的這個(gè)體系，從最后結(jié)果來看，效果還是不錯(cuò)滴，你可以試試啊 不是pcr過夜，是把配好的連接體系放到pcr儀里，程序設(shè)置成16℃（僅此一步）時(shí)間嘛我都是設(shè)成∞，到時(shí)候自己收就是了，你晚上做了早上收，不就過夜啦。 今天我的測序結(jié)果出來了，還不錯(cuò)，都測出來了，之前挑的單克隆大部分也都是陽性的，菌落雖然小點(diǎn)兒但是結(jié)果還不錯(cuò)。 你在挑菌的時(shí)候，要撿大小合適（不要太大的）、遠(yuǎn)離菌落群的單菌落，還有你最后菌落PCR的時(shí)候，最好用自己的特異性引物做，降低假陽性的幾率。 連接、轉(zhuǎn)化每一步都嚴(yán)格把關(guān)，總會(huì)成功的 祝你好運(yùn) |
15樓2014-04-18 19:20:36
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4樓2014-04-14 18:18:15
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8樓2014-04-15 16:32:48
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9樓2014-04-15 18:45:07
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10樓2014-04-15 21:23:43
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