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nbzhenzhen新蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌培養(yǎng) 質粒提取后困惑 已有8人參與
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最近老師要求做 實時熒光定量PCR的細菌16S rRNA基因全長的標品。老師說，用質粒克隆的方法制備這樣的標品。具體操作如下： 1.JM109 16s RNA基因全長的擴增（27f-1492r) 2.切膠純化回收 3.目的基因與載體（PMD 19-T vector）的連接：10ul，4℃，過夜。 4.將連接有目的基因的載體轉化至感受態(tài)細胞 DH5α：50ul感受態(tài)細胞與10ul以上溶液（第3步的）混合，冰上30min，42℃ 45s，冰上1min，加440ul SOC培養(yǎng)基37℃，180rpm，培養(yǎng)1h。 5.涂布：配制LB培養(yǎng)基，滅菌稍冷卻后，添加1/1000的Amp，倒平板制成固體培養(yǎng)基�；旌�30ul x-gal、7ul IPTG和63ul ddH2O，加至固體平板上，涂布均勻。 取10u l第4步培養(yǎng)液，混合90ul滅菌dd H2O,相當于稀釋10倍后，加至固體平板上，涂布均勻。 6.培養(yǎng)：倒置平板，待平板上的冷凝水晾干后，置于37℃，靜置培養(yǎng)過夜。 7.藍白斑篩選，培養(yǎng)：取出培養(yǎng)基，挑取白斑至3-4ml LB液體培養(yǎng)基（滅菌冷卻后加1/1000Amp）中，37℃，180rpm，幾個小時后，轉移至100ml LB液體培養(yǎng)基中（滅菌冷卻后加1/1000Amp）。37℃，180rpm，16h。 8.質粒提�。喝〉�7步培養(yǎng)后的菌液5ml，離心，棄上清。步驟按照TIANGEN質粒提取試劑盒。 問題就卡在了質粒提取后，出現(xiàn)3個條帶，如圖跑得最快的兩條最亮。問過同實驗室的師兄師姐，他們說未遇到過這種情況，他們提出來的質粒都是兩條，一條是不亮的基因組DNA，一條是亮的質粒。我不知道我的是怎么回事，質粒提取操作重復兩次，仍是一樣的結果。求解。 E.coli 質粒的提取.png |
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Neo2000
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