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314243568銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
真菌基因敲出抗生素假陽(yáng)性問(wèn)題！
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細(xì)菌，比如大腸桿菌，解淀粉芽孢桿菌等基因敲出很容易，而且用Amp等抗生素篩選標(biāo)記出現(xiàn)的假陽(yáng)性比例相當(dāng)?shù)汀?br />
但是，對(duì)于真菌來(lái)說(shuō)，這個(gè)就是一個(gè)頭疼的問(wèn)題，比如煙曲霉，黑曲霉等菌株，用潮霉素做篩選標(biāo)記，正常情況下無(wú)標(biāo)記的菌株是不能在含有抗生素的平板上生長(zhǎng)的，抗性標(biāo)記的質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)原生質(zhì)體后涂板篩選，按道理長(zhǎng)出來(lái)應(yīng)該基本上都是成功整合上基因組（不管整合正確與否）， 問(wèn)題就在于此，這一群篩選出來(lái)的轉(zhuǎn)化子重新轉(zhuǎn)接到含有潮霉素抗性的平板上基本上都能夠很好的生長(zhǎng)（有對(duì)照，對(duì)照不長(zhǎng)），這也就證明了其導(dǎo)入了潮霉素抗性基因，但是PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示全部error，基因組中無(wú)潮霉素基因片段。 這一情況我一直想不通，難道和潮霉素抗性機(jī)理相關(guān)？但是在黑曲霉中，我們也用了營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，結(jié)果相同。不知道同行們有什么能夠建議的，還望不吝賜教！ |
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2樓2014-08-01 11:26:05
jdhdragon
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3樓2014-08-01 16:58:03
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樓主有解淀粉芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法嗎？我做的一直假陽(yáng)性。真菌刪除可以采用分割標(biāo)記法，3次同源重組，想出來(lái)的基本是真的 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
6樓2017-10-19 10:18:42
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8樓2018-01-23 15:14:07
burma9
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你好，我最近也是用潮霉素篩選出現(xiàn)假陽(yáng)性，請(qǐng)問(wèn)你解決了嗎？實(shí)驗(yàn)做的好艱難啊 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
9樓2018-09-12 00:58:02
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