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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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liangte0705

金蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 片段連接到載體后，總在酶切位點(diǎn)處發(fā)生缺失已有3人參與

各位同學(xué)，我最近遇到了一個(gè)難題。我的一個(gè)2900bp大小的片段，通過(guò)XhoⅠ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)酶切后，連到POK-12載體上，通過(guò)pcr鑒定，片段連入了，但酶切鑒定失敗，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)從XhoⅠ開(kāi)始缺失300多bp堿基。我懷疑是片段和宿主菌發(fā)生了重組，因此換了許多感受態(tài)，例如DH5α，JM109，HB101,但仍然出現(xiàn)上述問(wèn)題。已經(jīng)一個(gè)多月了，仍然沒(méi)有解決，請(qǐng)各位同學(xué)幫幫忙，看看是不是有什么方法能夠解決，多謝大家了。

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1樓 2014-05-09 10:22:22

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Neo2000

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【答案】應(yīng)助回帖

★
liangte0705: 金幣+1 2014-05-10 13:51:18

建議片段先ta克隆后，測(cè)序?qū)α嗽偾邢聛?lái)

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4樓2014-05-10 07:31:34

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liutonglu

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liangte0705: 金幣+1, ★有幫助 2014-05-09 21:05:04
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-09 22:47:42

有可能是在你300多bp這個(gè)位置有另一個(gè)XhoI的酶切位點(diǎn)或者產(chǎn)生了星活性（如果有星活性要減少酶切時(shí)間）。所以酶切后跑膠回收要和未切的原始片段一起跑，每一步都確認(rèn)了就知道原因了。

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2樓2014-05-09 20:19:18

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Neo2000

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liangte0705: 金幣+1, ★有幫助 2014-05-10 13:50:48

重組的可能性不大，很可能是被切斷了，你有分析基因內(nèi)部酶切位點(diǎn)嗎？

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3樓2014-05-10 07:30:30

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panda73

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★
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liangte0705: 金幣+1 2014-05-10 13:51:11

那你PCR鑒定時(shí)大小就不正確吧？
XhoI酶切位點(diǎn)完整嗎？
不同的情況應(yīng)該具體分析。

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5樓2014-05-10 10:28:20

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