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108391銅蟲(chóng) (初入文壇)
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短RNA的變性聚丙烯酰胺電泳 已有1人參與
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近一個(gè)月都糾纏在這個(gè)問(wèn)題上了，我表達(dá)了一個(gè)RNA外切酶，找公司合成底物測(cè)酶活。底物為互補(bǔ)雙鏈，其中一條為20nt，另一條有20nt與之互補(bǔ)，但在3‘端多了10個(gè)A。酶是從3’端逐個(gè)逐個(gè)地切下核苷酸，產(chǎn)物為一系列酶切不完全的RNA，即在尿素-變性聚丙烯酰胺電泳上會(huì)出現(xiàn)多條帶。 目前糾結(jié)在怎么觀察結(jié)果上，試過(guò)銀染，效果不好，好多次都是一片空白。請(qǐng)問(wèn)跑過(guò)這種電泳的壇友們，有沒(méi)有什么好的顯示結(jié)果的方法呢？實(shí)驗(yàn)一次就要一天多時(shí)間，做不出結(jié)果心桑啊。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
108391(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-12 17:54:13
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RNA特異的切核酸酶？呵呵，要是我?guī)湍阆朕k法，你給點(diǎn)我用用？ 個(gè)人覺(jué)得，你這個(gè)方法測(cè)酶活，不地道， 不過(guò)你先要給點(diǎn)細(xì)節(jié)信息 你這個(gè)是ssRNA特異性的3‘-5’ exonuclease還是不區(qū)分ss和ds？ 還是說(shuō)，你設(shè)計(jì)的這個(gè)底物，就是想看這段overhang的ss-polyA被切的情況？ 實(shí)際上，對(duì)這種活性的酶，酶單位或者活力的定義不是這樣干的 有一些很方便的方法 比如你這個(gè)，如果是你這個(gè)底物，你用同位素標(biāo)記這段ss-polyA 測(cè)兩個(gè)常數(shù)，一個(gè)是底物的絕對(duì)質(zhì)量，一個(gè)是底物的絕對(duì)放射性強(qiáng)度 然后加入你這個(gè)酶 反應(yīng)之后，exonuclease會(huì)把ss-polyA切成AMP 這個(gè)時(shí)候利用TCA只能沉淀polynucleotide，而不能沉淀NTP之類(lèi)的特性 把產(chǎn)物點(diǎn)在一個(gè)濾紙片上，這個(gè)時(shí)候的放射性強(qiáng)度，比如R1，質(zhì)量，比如m1 然后用TCA洗這個(gè)濾紙片，洗個(gè)幾次，free-NTP就丟掉了 再測(cè)放射性強(qiáng)度，比如R2 這個(gè)時(shí)候你可以算出剩余的產(chǎn)物m2 因?yàn)闃?biāo)記之后 R1/m1=R2/m2 就可以算出有多少質(zhì)量變成AMP走掉了 相等于你可以得到，你這個(gè)酶，在這么個(gè)體系里面，產(chǎn)生了多少AMP 專(zhuān)業(yè)的說(shuō)法： “1個(gè)活性單位是指，X oC、X min內(nèi)催化釋放X nmol酸性可溶性核苷酸所需要的酶量” |
2樓2014-05-12 17:52:35
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送紅花一朵 |
開(kāi)眼了，相當(dāng)好的提議。我這個(gè)酶是從3‘端開(kāi)始逐個(gè)切除核苷酸，底物要求是RNA單鏈或3’端有一段>7nt overhang的RNA雙鏈，由于文獻(xiàn)報(bào)道用本法證明此酶有3’-5‘核酸外切酶活性，只是它顯示核酸的方法是用5‘ P32標(biāo)記，我們這邊沒(méi)法做放射性的東西，所以就折騰在這個(gè)顯示RNA的方法上面。原來(lái)也試過(guò)5’端熒光標(biāo)記，我們這邊的化學(xué)發(fā)光儀不行，直接點(diǎn)熒光標(biāo)記的RNA上去都檢測(cè)不到熒光。⊙﹏⊙b汗 如果有別的方法可以測(cè)，那也相當(dāng)好呢。我只有18個(gè)金幣，新蟲(chóng)，不過(guò)還是要送前輩一朵紅花，如果有條件做的話我想前輩提供的方法更好，還可以定量。 |
3樓2014-05-13 11:55:41
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西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-14 15:01:14
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條件艱苦不容易，再給你一個(gè)方案，但是這個(gè)不是什么nulease都可以試，需要nuclease活性比較強(qiáng)才行。 從oligonucleotides到nucleoside，也就是被nuclease切了，通過(guò)A260nm的光吸收，檢測(cè)“增色效應(yīng)”程度，也可以描述。 利用的是A260nm處消光系數(shù)有： 雙鏈多聚核苷酸<單鏈多聚核苷酸<寡核苷酸<核苷酸<核苷<堿基的固有特性 也就是說(shuō)，當(dāng)你的底物，給了一個(gè)dsRNA-3‘-oligoA-overhang 被exo切，產(chǎn)生了NMP 這個(gè)時(shí)候A260會(huì)有所增加。 一般，商業(yè)化的RNaseA之類(lèi)的，強(qiáng)悍有力的nuclease，就是用這種方式定義活性單位的： 比如 “1個(gè)活性單位是指，在37oC（pH5.0）條件下，水解酵母RNA溶液導(dǎo)致其260nm波長(zhǎng)光吸收值增加1.0所需要的酶量”。 你可以一試，這個(gè)很簡(jiǎn)單的，儀器要求也不多，RNA完全不需要標(biāo)記。 |
5樓2014-05-13 15:36:25
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8樓2014-05-15 21:07:36
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