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108391銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
短RNA的變性聚丙烯酰胺電泳 已有1人參與
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近一個月都糾纏在這個問題上了，我表達了一個RNA外切酶，找公司合成底物測酶活。底物為互補雙鏈，其中一條為20nt，另一條有20nt與之互補，但在3‘端多了10個A。酶是從3’端逐個逐個地切下核苷酸，產(chǎn)物為一系列酶切不完全的RNA，即在尿素-變性聚丙烯酰胺電泳上會出現(xiàn)多條帶。 目前糾結(jié)在怎么觀察結(jié)果上，試過銀染，效果不好，好多次都是一片空白。請問跑過這種電泳的壇友們，有沒有什么好的顯示結(jié)果的方法呢？實驗一次就要一天多時間，做不出結(jié)果心桑啊。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-05-14 15:01:14
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-05-14 15:01:14
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條件艱苦不容易，再給你一個方案，但是這個不是什么nulease都可以試，需要nuclease活性比較強才行。 從oligonucleotides到nucleoside，也就是被nuclease切了，通過A260nm的光吸收，檢測“增色效應(yīng)”程度，也可以描述。 利用的是A260nm處消光系數(shù)有： 雙鏈多聚核苷酸<單鏈多聚核苷酸<寡核苷酸<核苷酸<核苷<堿基的固有特性 也就是說，當你的底物，給了一個dsRNA-3‘-oligoA-overhang 被exo切，產(chǎn)生了NMP 這個時候A260會有所增加。 一般，商業(yè)化的RNaseA之類的，強悍有力的nuclease，就是用這種方式定義活性單位的： 比如 “1個活性單位是指，在37oC（pH5.0）條件下，水解酵母RNA溶液導致其260nm波長光吸收值增加1.0所需要的酶量”。 你可以一試，這個很簡單的，儀器要求也不多，RNA完全不需要標記。 |
5樓2014-05-13 15:36:25
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
108391(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2014-05-12 17:54:13
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
108391(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2014-05-12 17:54:13
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RNA特異的切核酸酶？呵呵，要是我?guī)湍阆朕k法，你給點我用用？ 個人覺得，你這個方法測酶活，不地道， 不過你先要給點細節(jié)信息 你這個是ssRNA特異性的3‘-5’ exonuclease還是不區(qū)分ss和ds？ 還是說，你設(shè)計的這個底物，就是想看這段overhang的ss-polyA被切的情況？ 實際上，對這種活性的酶，酶單位或者活力的定義不是這樣干的 有一些很方便的方法 比如你這個，如果是你這個底物，你用同位素標記這段ss-polyA 測兩個常數(shù)，一個是底物的絕對質(zhì)量，一個是底物的絕對放射性強度 然后加入你這個酶 反應(yīng)之后，exonuclease會把ss-polyA切成AMP 這個時候利用TCA只能沉淀polynucleotide，而不能沉淀NTP之類的特性 把產(chǎn)物點在一個濾紙片上，這個時候的放射性強度，比如R1，質(zhì)量，比如m1 然后用TCA洗這個濾紙片，洗個幾次，free-NTP就丟掉了 再測放射性強度，比如R2 這個時候你可以算出剩余的產(chǎn)物m2 因為標記之后 R1/m1=R2/m2 就可以算出有多少質(zhì)量變成AMP走掉了 相等于你可以得到，你這個酶，在這么個體系里面，產(chǎn)生了多少AMP 專業(yè)的說法： “1個活性單位是指，X oC、X min內(nèi)催化釋放X nmol酸性可溶性核苷酸所需要的酶量” |
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1083912樓2014-05-12 17:52:35
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