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pPIC9表達(dá)質(zhì)粒XhoI/EcoRI雙酶切 已有2人參與
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| 請問一下，我現(xiàn)在做pPIC9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，連上200bp目的片段，并做了PCR和測序鑒定，都是正確的。但現(xiàn)在用XhoI和EcoRI雙酶切，除了切出pPIC9、200bp的目的條帶外，在1000-2000bp處還有一條弱弱的條帶，不知道是怎么回事，我已經(jīng)檢查了質(zhì)粒里都分別只有一個XhoI和EcoRI的酶切位點(diǎn)，那這個表達(dá)質(zhì)粒算是構(gòu)建成功了嗎，直接線性化做表達(dá)的話會有什么影響嗎？請各位高手指點(diǎn)。謝謝！ |
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2樓2014-05-19 16:20:10
luwei13566
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3樓2014-05-19 20:19:27
4樓2014-05-20 16:49:25
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5樓2014-05-20 19:37:55
6樓2014-05-21 10:18:20
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【答案】應(yīng)助回帖
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pPIC9K的BamHI位點(diǎn)在α-signal sequence前面，整個質(zhì)粒上還有幾個和酶識別位點(diǎn)差一個堿基的位點(diǎn)，如果酶切條件不合適都可能切出來，如果酶切不完全質(zhì)粒的超螺旋沒去除干凈也會出現(xiàn)條帶，只要你用通用引物測序正確就說明你的基因連在了正確的位置上，你雙酶切回收的片段也是正確的，如果回收的片段不對的話首先你很難連上，就算連上大小也不對，測序不是多克隆位點(diǎn)里沒東西就是擴(kuò)增不出來?xiàng)l帶�，F(xiàn)在的結(jié)果不影響你后期的線性化。 還有LZ你把9K的信號肽切掉了難道是想胞內(nèi)表達(dá)？ |
7樓2014-05-21 14:36:14
8樓2014-05-21 16:37:36
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