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我需要做目的基因的表達(dá)，現(xiàn)在已經(jīng)克隆完成，回收質(zhì)粒后，總是感覺(jué)質(zhì)粒的濃度不夠高，所以在雙酶切后（由于沒(méi)有通用緩沖液，所以是在分別酶切），感覺(jué)產(chǎn)物濃度更低，有時(shí)電泳條帶都看不清。
那我可以直接用克隆回收后的質(zhì)粒作為PCR模板，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，電泳回收產(chǎn)物，再將這個(gè)產(chǎn)物作為底物來(lái)進(jìn)行雙酶切操作以及后續(xù)與表達(dá)載體的連接嗎？

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1樓 2014-05-22 16:14:37

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8樓: Originally posted by 呀薯?xiàng)l at 2014-05-24 09:55:08
既然這樣可以，那為什么不可以直接在最初PCR后就進(jìn)行酶切然后與表達(dá)載體的連接。。而是要通過(guò)與克隆載體連接后在進(jìn)行后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?br />
實(shí)驗(yàn)新手，，謝謝指導(dǎo)啊...

本來(lái)就可以的啊。很多人就這么做。至于先克隆到t載體等擴(kuò)增載體是由于連接相對(duì)容易，而直接連接表達(dá)載體要難一點(diǎn)。到擴(kuò)增載體后可以快速測(cè)序，從而調(diào)整實(shí)驗(yàn)。這些個(gè)找周圍實(shí)驗(yàn)室的問(wèn)問(wèn)不就很快就好了，就這么不好意思問(wèn)。

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9樓2014-05-24 10:14:54

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9樓: Originally posted by for5 at 2014-05-24 10:14:54
本來(lái)就可以的啊。很多人就這么做。至于先克隆到t載體等擴(kuò)增載體是由于連接相對(duì)容易，而直接連接表達(dá)載體要難一點(diǎn)。到擴(kuò)增載體后可以快速測(cè)序，從而調(diào)整實(shí)驗(yàn)。這些個(gè)找周圍實(shí)驗(yàn)室的問(wèn)問(wèn)不就很快就好了，就這么不好意 ...

濃度低可以做的啊，我經(jīng)常這樣做的啊，有時(shí)候跑膠都看不清楚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還挺好。

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10樓2014-05-24 11:23:27

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呀薯?xiàng)l(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-22 19:25:00
呀薯?xiàng)l: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-05-23 11:54:18

那就質(zhì)粒多提一點(diǎn)，膠回收好好做，回收率會(huì)高不少。濃度低點(diǎn)也可以做連接，只要基因和載體切干凈就好，連接就是概率問(wèn)題。

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2樓2014-05-22 16:22:13

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2樓: Originally posted by for5 at 2014-05-22 16:22:13
那就質(zhì)粒多提一點(diǎn)，膠回收好好做，回收率會(huì)高不少。濃度低點(diǎn)也可以做連接，只要基因和載體切干凈就好，連接就是概率問(wèn)題。

那要是以回收的質(zhì)粒為模板做個(gè)PCR，再電泳回收產(chǎn)物，然后再進(jìn)行后續(xù)的酶切、連接等這樣的做法可以嗎？

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3樓2014-05-22 18:10:53

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3樓: Originally posted by 呀薯?xiàng)l at 2014-05-22 18:10:53
那要是以回收的質(zhì)粒為模板做個(gè)PCR，再電泳回收產(chǎn)物，然后再進(jìn)行后續(xù)的酶切、連接等這樣的做法可以嗎？...

可以的啊

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4樓2014-05-22 18:13:25

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5樓2014-05-23 06:06:06

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4樓: Originally posted by for5 at 2014-05-22 18:13:25
可以的啊
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6樓2014-05-24 09:54:46

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4樓: Originally posted by for5 at 2014-05-22 18:13:25
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7樓2014-05-24 09:54:55

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5樓: Originally posted by meng_xu at 2014-05-23 06:06:06
可以，不過(guò)你到后來(lái)還要再測(cè)序，保證序列正確就可以

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8樓2014-05-24 09:55:08

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