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SIQING2013

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[求助] DNA提取總是降解，核酸定量OD比值異常，幫忙分析一下電泳圖已有3人參與

提取線蟲(chóng)DNA，新鮮組織，用液氮研磨成粉狀，然后用稱(chēng)量勺轉(zhuǎn)移至離心管，然后加入緩沖液DS200ul，混勻，然后加蛋白酶K20ul，55度，2h,然后加裂解液MS 220ul，65度，10min，然后加無(wú)水乙醇220ul，轉(zhuǎn)移至純化膜，離心，棄廢液；然后用蛋白漂洗夜PS，漂洗，再用漂洗液PE漂洗兩次，再加入50-80ulTE洗脫。用的是東盛基因組提取試劑盒。電泳圖如下
三哥泳道都點(diǎn)了10ul，樣品1第一泳道核酸定量結(jié)果如下：濃度23.6ng/ul，A260/280:1.68，A260/230: -0.76,A230:-0.620;
樣品2第二泳道核酸定量結(jié)果如下：濃度56.5ng/ul，A260/280：1.8，A260/230：-9.98，A230：-0.113.
MARKER用的是takara的15000 ladder,取10ul，每條帶越100ng，
另外，對(duì)樣品1和2用Picogreen試劑盒定量結(jié)果顯示，樣品1的濃度為47.67ng/ul, 樣品2的濃度為：73.68ng/ul。注：Picogreen試劑盒為對(duì)雙鏈DNA具有特異性結(jié)合的熒光染料定量，可避免RNA,SSDNA的干擾，定量同時(shí)做的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.997.
問(wèn)題：1：從電泳上看，DNA存在降解。我最近連續(xù)提了三個(gè)星期了，整個(gè)過(guò)程也避免漩渦震蕩，基本用手顛倒混勻，還是沒(méi)辦法解決，求高手指點(diǎn)。
2：DNA定量感覺(jué)都不準(zhǔn)。舉一個(gè)例子，從條帶亮度來(lái)看，樣品一的亮度不如MARKER亮，但是后面OD值和熒光定量結(jié)果都遠(yuǎn)高于100ng,也就是應(yīng)該高于marker的100ng. 不知道熒光定量結(jié)果可不可信。我最終要根據(jù)熒光定量的結(jié)果來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，很糾結(jié)。
3: 樣品1是被我稀釋了差不多三倍的結(jié)果，之前的亮度跟樣品2相似。在經(jīng)過(guò)兩天4度的放置以及稀釋后，拖帶看起來(lái)變得沒(méi)有那么明顯。在剛剛提出來(lái)放置2h后跑過(guò)一次電泳，拖帶比這個(gè)嚴(yán)重。這個(gè)應(yīng)該怎么解釋:
實(shí)驗(yàn)做了快七八九個(gè)月了，一點(diǎn)進(jìn)展都沒(méi)有，非常煩惱，跪求各位大俠指點(diǎn)迷津，，，，

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1樓 2014-05-27 16:17:07

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飛約瘋?cè)嗽?/a>

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引用回帖:

3樓: Originally posted by SIQING2013 at 2014-05-27 17:25:15
謝謝你的建議。不過(guò)我的實(shí)驗(yàn)方法是參考文獻(xiàn)的，文獻(xiàn)不建議用酚氯仿抽提。...

不用客氣，

回復(fù)此樓

人生貴在行動(dòng)，遲疑不決時(shí)，不妨先邁出小小一步。

4樓2014-05-27 17:26:55

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飛約瘋?cè)嗽?/a>

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
SIQING2013: 金幣+2 2014-05-27 17:29:22
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-27 18:51:05

1.建議樓主在提取的DNA中加入RNA酶，然后在測(cè)濃度，RNA會(huì)干擾DNA濃度，即使是試劑盒也不行的
2.試驗(yàn)中的所有離心管和PCR管，研缽都要經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理

3.試劑盒也有他的缺點(diǎn)，建議用最普通且實(shí)用的CTAB法提取，方法如下：
（1）取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；
（2）加入800 μl的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65℃水浴預(yù)熱），每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000 r/min，離心15 min；
（3）小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各400μl）溶液，混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min；
（4）小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min。
（5）重復(fù)步驟（4）1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；
（6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，離心10 min；
（7）棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
（8）室溫下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去離子水中，于-20℃或者-70℃下保存?zhèn)溆谩?

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2樓2014-05-27 16:33:54

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SIQING2013

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 飛約瘋?cè)嗽?/i> at 2014-05-27 16:33:54
1.建議樓主在提取的DNA中加入RNA酶，然后在測(cè)濃度，RNA會(huì)干擾DNA濃度，即使是試劑盒也不行的
2.試驗(yàn)中的所有離心管和PCR管，研缽都要經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理

3.試劑盒也有他的缺點(diǎn)，建議用最普通且實(shí)用的CTAB法提 ...

謝謝你的建議。不過(guò)我的實(shí)驗(yàn)方法是參考文獻(xiàn)的，文獻(xiàn)不建議用酚氯仿抽提。

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3樓2014-05-27 17:25:15

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
SIQING2013: 金幣+2 2014-05-30 10:49:36

有可能DNA提取的試劑被污染了。

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5樓2014-05-29 10:33:01

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