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藍(lán)默兒金蟲 (小有名氣)
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[求助]
夾心ELISA，陰性值、空白值過高。 已有4人參與
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一、酶標(biāo)抗體是我自己的標(biāo)記的，用原核表達(dá)的蛋白（1微克/ml）包被驗(yàn)證，同時(shí)設(shè)空白對照，酶標(biāo)抗體稀釋1：:10000時(shí)，OD值=1.0， 建夾心ELISA方法：1.用方陣法確定多抗和酶標(biāo)抗體稀釋濃度都為1:2000時(shí)，OD值=1.0左右 2.鼠源多抗包被（稀釋度1:2000）；封閉液為5%脫脂乳封閉，37°，2h；抗原為純化的蛋白（2微克/ml，），同時(shí)設(shè)陰性對照（胎牛血清），空白對照（PBS）；用標(biāo)記的酶標(biāo)抗體進(jìn)行檢測（稀釋度1:2000），之后TMB顯色，終止讀數(shù)。陽性O(shè)D值=1.0左右，陰性O(shè)D值=0.8左右、空白OD值=0.8左右。 3，為什么陰性值，空白值那么高，難到酶標(biāo)單抗與多抗反應(yīng)了，不應(yīng)該�。渴笤炊嗫购褪笤磫慰狗磻�(yīng)了？ 4，感覺也不是封閉液的問題，板子不包被，直接封閉液為5%脫脂乳封閉，37°，2h，加酶標(biāo)抗體進(jìn)行檢測，OD值=0.15以下。 之后我又用單抗包被，結(jié)果一樣：陰性、空白值好高。 1.包被：將三種單抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀釋，做三個(gè)平行，4°過夜。 2.第二天洗滌4次，每次3min，拍干。5%脫脂乳封閉，37°，2h。 3.洗滌4次，每次3min，拍干。加抗原（為純化好的原核表達(dá)蛋白）稀釋濃度為2微克/ml，同時(shí)設(shè)陰性對照（胎牛血清1：100稀釋），空白對照（PBS溶液)。37°，1h。 4.洗滌4次，每次3min，拍干。加酶標(biāo)抗體（1:1000稀釋），37°，1h。 5.洗滌4次，每次3min，拍干。加TMB顯色，每孔100微升。37°，10min。 6.2M硫酸終止， 7.OD450讀數(shù)。 結(jié)果，陽性值2.5，陰性對照和空白值很高可達(dá)到1.5。 之后我又用細(xì)胞上清包被，其他和上面一樣，加酶標(biāo)抗體（1:1000稀釋），封閉用的是1%明膠和2%的BSA，2%的BSA封閉：陰性值1.8，陽性和空白值都在2.0以上。1%明膠封閉：陰性值1.0，陽性和空白值都在2.0以上 |
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